Аналитическое ультрацентрифугирование

В отличие от препаративного центрифугирования, целью которого является разделение веществ и их очистка, аналитическое ультрацентрифугирование применяется в основном для изучения седиментационных свойств биологических макромолекул и других структур. Поэтому в аналитическом центрифугировании применяют роторы и регистрирующие системы особой конструкции: они позволяют непрерывно наблюдать за седиментацией материала в центробежном поле.

Аналитическое ультрацентрифугирование полимеров включает в себя три следующих экспериментальных метода: скоростную седиментацию, изучение седиментационного равновесия и процесса приближения к нему.

Определение молекулярного веса по скорости седиментации – это наиболее распространенный метод. Центрифугирование проводят при больших скоростях, так что частицы, вначале равномерно распределенные по всему объему, начинают упорядочение перемещаться по радиусу от центра вращения. Между областью растворителя, уже свободной от частиц, и той его частью, которая их содержит, образуется четкая граница раздела. Эта граница при центрифугировании перемещается, что дает возможность определять скорость седиментации частиц при помощи одного из вышеупомянутых методов, регистрируя это перемещение на фотопластинке.

Скорость седиментации определяется следующим соотношением:

Где х – расстояние от оси вращения в см,

t – время в с,

w – угловая скорость в рад-с^-1,

s – коэффициент седиментации молекулы.

Коэффициент седиментации -- это скорость, отнесенная к единице ускорения, его измеряют в единицах Сведберга; 1 единица Сведберга равна 10^_13с. Численное значение s зависит от молекулярного веса и формы частиц и является величиной, характерной для данной молекулы или надмолекулярной структуры. Например, коэффициент седиментации лизоцима равен 2,15 S; катал аза имеет коэффициент седиментации 11.35S, субъединицы рибосом бактерий -- от 30 до 50S, а субъединицы рибосом эукариотов -- от 40 до 60S.

Где М – молекулярный вес молекулы, R– газовая постоянная, Т – абсолютная температура, s – коэффициент седиментации молекулы, D –коэффициент диффузии молекулы, v – парциальный удельный объем, который можно рассматривать как объем, занимаемый одним граммом растворенного вещества, р – плотность растворителя. Скоростная седиментация позволяет определить константу седиментации и полидисперсность образца. Седиментация макромолекул в зоне (зонное ультрацентрифугирование) – ценный метод обнаружения гетерогенности высокомолекулярного образца.

Метод приближения к седиментационному равновесию был разработан для того, чтобы избавиться от недостатков предыдущего метода, связанных с большими затратами времени, необходимого для установления равновесия. С помощью этого метода можно определять молекулярные веса, когда центрифугируемый раствор находится в состоянии приближения к равновесию. Вначале макромолекулы распределяются по всему объему аналитической ячейки равномерно; затем по мере центрифугирования молекулы оседают, и плотность раствора в области мениска постепенно уменьшается. Изменение плотности тщательно регистрируют, а затем путем сложных расчетов, включающих большое число переменных, определяют молекулярный вес данного соединения по формулам

Метод приближения к равновесию позволяет рассчитать молекулярную массу М и получить сведения о неоднородности полимера, а изучение седиментационного равновесия (состояния, достигаемого транспортным переносом макромолекул, хотя сам метод и не является истинно транспортным) – молекулярную массу (надежнее, но с большей затратой времени, чем в предыдущем методе) различных типов усреднения.

Метод центрифугирования в градиенте плотности заключается в исследовании седиментации, состояния равновесия и приближения к нему в условиях искусственно создаваемого в кювете градиента плотности это – широко используемый метод определения молекулярной массы, наличия неоднородности и ее типа, служащий и для препаративных разделительных целей.

Аналитические ультрацентрифуги имеют оптическую систему, которая позволяет регистрировать на фотопленках результаты ультрацентрифу– гирования. В аналитических ультрацентрифугах производится также определение констант седиментации частиц, что позволяет затем рассчитывать их молекулярные веса.

Аналитические ультрацентрифуги могут развивать скорость до 70000 об/мин, при этом ускорение до 500000g. Ротор у них, как правило, имеет форму эллипсоида и соединен посредством струны с двигателем, что позволяет варьировать скорость вращения ротора. Ротор вращается в вакуумной камере снабженной холодильной установкой, и имеет две ячейки аналитическую и балансировочную, которые устанавливаются в центрифуге строго вертикально параллельно оси вращения.

Балансировочная ячейка служит для уравновешивания аналитической и представляет собой металлический блок с прецизионной системой. В ней имеются два индексных отверстия, находящиеся на строго определенном расстоянии от оси вращения, с помощью которых определяют соответствующие расстояния аналитической ячейки. Аналитическая ячейка, емкость которой, как правило, равна 1 см³, имеет секторальную форму. При правильной установке в роторе она, несмотря на то, что стоит вертикально, работает по тому же принципу, что и ротор с подвесными стаканами, создавая практически идеальные условия седиментации.