Ультрацентрифугирование, как метод разделения

Содержание

Введение ………………………………………………………………………….3

1 Ультрацентрифуга ……………………………………………………………..4

2 Ультрацентрифугирование, как метод разделения ………………………….6

2.1 Препаративное ультрацентрифугирование ………………………………...6

2.2 Аналитическое ультрацентрифугирование ………………………………...7

3 Сфера использования ультрацентрифугирования ………………………….10

Заключение ……………………………………………………………………...11

Список использованной литературы …………………………………………..12

Введение

Возможность использования высокоскоростного центрифугирования для ускоренного осаждения частиц из коллоидных растворов и определения их размеров была впервые предложена российским химиком Думанским еще в 1913 году. Эта идея получила практическую реализацию спустя 11 лет благодаря шведскому изобретателю Сведбергу, который разработал лабораторную ультрацентрифугу с оригинальной конструкцией ротора и функцией анализа осаждаемых частиц, способную развивать ускорение до 10g.

Еще через три года Сведберг впервые определил молекулярный вес гемоглобина и альбумина с помощью седиментации.

А измерение молекулярного веса гемоглобина в 1927 году сочетанным методом диффузии и осаждения позволило ученому сделать предположение о макромолекулярной структуре белков. Впоследствии это предположение полностью подтвердилось.

Опыты Сведберга открыли перед естествоиспытателями принципиально новые возможности и вызвали огромный интерес к ультрацентрифу–гированию. Это, в свою очередь, стало мощным стимулом для совершенствования приборов.

10-20 лет тому назад скоростные ультрацентрифуги составляли едва ли не главную часть приборного оснащения любой биохимической лаборатории.

Сейчас, когда молекулярная биология перешла на работу с микроколичествами исходных материалов, эти дорогие и капризные машины заняли куда более скромное место в арсенале исследователей. Тем не менее, в некоторых случаях, когда предполагается начать обширную программу изучения какого-нибудь однородного биологического материала, имеет смысл воспользоваться возможностями ультрацентрифугирования. Поэтому в этой главе мы весьма кратко познакомимся с этими возможностями.

Ультрацентрифуга

Этим термином принято называть центрифуги, позволяющие достигать скорости вращения своих роторов вплоть до 80 тысяч оборотов в минуту. На радиусе ротора в 6 см это создает в радиальном направлении ускорение в 700 тысяч раз превышающее ускорение земного притяжения («700 000 g»). Препарат ДНК с массой в 0,5 микрограмма, при такой скорости вращения испытывал бы силу, влекущую его к периферии ротора, эквивалентную весу в 350 миллиграмм. А это – уже весьма ощутимая величина.

Вот уже на протяжении почти полувека ультрацентрифуга широко используется при изучении полимеров. С течением времени ее значение непрерывно возрастает. Биологи широко используют ультрацентрифугу для препаративных и аналитических целей, поскольку она дает возможность, расходуя очень небольшие количества вещества, определять многие его параметры и осуществлять очень тонкое фракционирование.

Вращение с такой скоростью невозможно осуществить в нормальной атмосфере из-за катастрофического разогрева ротора. Поэтому главным элементом конструкции ультрацентрифуги является вакуумная камера, в которой вращается ротор. Используя последовательное подключение к камере диффузионного масляного и обычного форвакуумного насосов, в ней удается достигнуть разрежения в 10-³ мм ртутного столба. Отсюда возникают технические трудности с обеспечением герметичности камеры – как по окружности ее довольно большой крышки, так и по оси мотора, вращающего ротор, поскольку этот мотор, естественно, располагается вне камеры. Столь же надежно должны быть герметизированы съемными колпачками и пробирки, устанавливаемые в ротор. В противном случае находящаяся в них жидкость закипит и улетучится.

Несмотря на столь высокий вакуум, роторы при такой огромной скорости вращения все же нагреваются, и потому их приходится охлаждать (через инфракрасное излучение) путем контролируемого интенсивного охлаждения стенок камеры. Что тоже составляет проблему, поскольку камера изготавливается из брони, толщиной в 2 – 3 см. Ее назначение – защитить оператора в случае разрыва ротора центробежными силами. Такое случается, если в материале ротора есть скрытый дефект. Или при слишком длительном использовании ротора, у которого есть предельный срок службы, определяемый «усталостью» материала. Высокоскоростные роторы изготавливаются из титана, низкоскоростные – из дюралюминия.

Ультрацентрифуги комплектуются, по выбору покупателя, набором разнообразных роторов: на большие скорости вращения и малые объемы пробирок, или наоборот, – на большие объемы и относительно малые скорости. Объемы пробирок варьируют в широких пределах: от 6,5 до 94-х миллилитров.

Используются (в основном) роторы двух типов: угловые и со свободно подвешенными (откидывающимися) пробирками. Второй тип роторов часто называют «бакет-роторами». Эти роторы несут три или шесть пробирок, которые устанавливают в свободно подвешенные металлические гильзы – «бакеты» (от английского bucket – ведро). Пробирки герметизируются крышками, навинчивающимися через прокладки на бакеты. Последние сначала висят вертикально, опираясь на гибкую ось. Но уже на малых скоростях вращения бакеты откидываются до горизонтального положения, ось прогибается, а они своими полу сферическими наружными краями опираются на соответствующие гнезда в самом роторе – так, что центробежная сила передается не на подвеску, а на само массивное тело ротора.

В угловых роторах (рис.1) гнезда для пробирок выполнены в самом теле ротора. Размеры гнезд и угол их наклона варьируют в широких пределах. Число гнезд всегда четное.

Рисунок 1 – угловой ротор

Перед установкой в ротор заполненные пробирки вместе с еще не установленными на них колпачками попарно уравновешиваются (добавлением жидкости) весьма тщательно. В противном случае неизбежны опасные биения ротора при вращении. То же самое относится к бакет–роторами с шестью пробирками. В случае трех пробирок все они, вместе с бакетами и их крышками должны иметь совершенно одинаковый вес. Для каждого типа роторов указывается максимально допустимая скорость вращения.

К этой технической части описания ультрацентрифуги остается добавить, что все рабочие параметры процесса центрифугирования: скорость и продолжительность вращения, температура ротора и даже степень плавности его остановки задаются предварительно и далее обеспечиваются автоматически контрольными устройствами самого прибора.

В бакет-роторах частицы, оседающие под действием центробежной силы, движутся вдоль оси пробирки и оседают на ее сферическое дно. В угловых роторах частицы движутся сначала горизонтально в направлении наиболее удаленной от оси вращения стенки пробирки, затем по ней соскальзывают вниз и собираются в самой дальней части пробирки – в месте перехода от ее цилиндрической стенки к сферическому дну

Ультрацентрифугирование, как метод разделения

Ультрацентрифугирование – метод разделения и исследования высокомолекулярных соединений, вирусов и субклеточных частиц с помощью ультрацентрифуги. Метод заключается в том, что белки в центрифужной пробирке помещают в ротор ультрацентрифуги. При вращении ротора скорость оседания белков пропорциональна их молекулярной массе: более тяжёлые белки образуют фракции, расположенные ближе ко дну кюветы, более лёгкие – к поверхности.

Скорость осаждения зависит преимущественно от молекулярного веса белка. Теория ультрацентрифугирования белков и приложения этого метода для исследований размера и формы белковой молекулы будут рассмотрены в гл. VI. Здесь отметим только, что метод может быть использован и в препаративных целях. Теоретически эффективность такого разделения должна быть значительной. На практике, однако, возникают труднопреодолимые препятствия. Максимальная дистанция, которую проходят белки в кювете ультрацентрифуги, невелика, в результате чего удается обособить лишь крайние фракции. Нелегко предотвратить перемешивание участков жидкости в кювете при остановке центрифуги.

Принято различать 2 типа ультрацентрифугирования: препаративное и аналитическое.