Р а б о т а 6. Пассирование каллусной ткани

Р а б о т а 4. КУЛЬТУРА КАЛЛУСНОЙ ТКАНИ

Материалы и оборудование. Стерильное растение картофеля в пробирке, стерильный пинцет и скальпель, стерильные бумажные "матрасики", газовая горелка или спиртовка, спирт, маточные растворы для приготовления среды Мурасиге-Скуга, растворы 2,4-Д и 6-БАП (1 мг/л), чашки Петри, колбы Эрленмейера на 100 мл, мерный цилиндр, пипетки.

Объяснение. В ответ на ранение паренхимные клетки, расположенные под эпидермисом, дедифференцируются, переходят к делению и образуют недифференцируемую ткань, получившую название каллуса. Образование и рост каллуса регулируется ауксинами и цитокининами. Успех получения каллусной ткани в большой мере зависит от удачного подбора регулятора роста. В настоящее время каллусные культуры индуцируются практически из любого органа ткани или растения.

Ход работы. Работа выполняется в четырех вариантах. Различие вариантов обусловлено содержанием фитогормонов в питательных средах, приготовленных на основе среды Мурасиге-Скуга.

В каждую из четырех колб Эрленмейера на 50 мл прилить небольшое количество дистиллированной воды и следующие маточные растворы: 5 мл макросолей; 0,5 мл микросолей; 0,25 мл хелата железа; 1,0 мл витаминов; 5,0 мл мезоинозита. Затем в каждую колбу добавить 3 г сахарозы. После этого в три колбы добавляют по одному из следующих фитогормонов: 2,4-Д (1мл/л), 6-БАП (1мл/л), 2,4-Д + 6-БАП. В четвертую колбу фитогормоны не добавляют (контроль). Полученные растворы переливают в мерные цилиндры и доводят объем до 50 мл, рН – до 5,6 – 5,8, используя 0,1н. КОН. Затем добавляют агар-агар (по 0,4 г на каждый вариант среды) и в колбах автоклавируют среду.

Р а б о т а 5. ПОЛУЧЕНИЕ И КУЛЬТИВИРОВАНИЕ

КАЛЛУСА ИЗ РАЗЛИЧНЫХ ЭКСПЛАНТОВ КАРТОФЕЛЯ

Материалы и оборудование: стерильное растение картофеля в пробирке, стерильный пинцет и скальпель, стерильные бумажные "матрасики" и чашки Петри, спиртовка, спирт, стерильная питательная среда для получения и культивирования каллуса картофеля в колбе или пробирке, парафилм, ножницы, спички.

Объяснение. Каллус – это неорганизованная масса ткани, состоящая из дедифференцированных клеток. Образование и рост каллусной ткани контролируются фитогормонами из группы ауксинов и цитокининов. Под действием ауксинов и цитокининов из-за высокой интенсивности клеточных делений не происходит дифференцировка тканей, в результате чего образуется каллус. Для индукции каллусообразования используются питательные среды с высоким соотношением ауксинов к цитокининам (до 10:1).

Каллусную ткань можно получить на искусственных питательных средах, включающих фитогормоны, используя фрагменты (экспланты) самых разных частей растений: стеблей, корней, тканей клубня, листьев, зародышей и др.

Ход работы. Пробирки с растениями протереть спиртом, горлышко обжечь. Пинцетом вынуть стерильное растение из пробирки и выложить его на стерильный бумажный "матрасик". Придерживая растение пинцетом, вырезать скальпелем участки стебля длиной 5–10мм, листочки, участки корня. Надсечь экспланты острым скальпелем в нескольких местах, в которых в дальнейшем начнется каллусогенез.

Нагреть стерильную питательную среду на плитке до расплавления агара. Одновременно подготовить ламинар-бокс к работе (протереть изнутри спиртом).

Открыть колбу с питательной средой, обжечь ее горлышко над пламенем спиртовки и в стерильные чашки Петри разлить среду по 15–30мл. Чашки держать открытыми минимальное время. Дать среде застыть (10–15 минут).

 Надсеченные экспланты разместить на поверхности застывшей питательной среды, чуть вдавливая их пинцетом для усиления контакта со средой. В одну чашку помещают 10–20 эксплантов. Закрыть чашку Петри и заклеить парафилмом в два слоя. Парафилм следует равномерно натягивать для предотвращения разрывов при его усыхании. Поставить чашки Петри в термостат без освещения при температуре 22–25^оС и влажности 70%. Через три недели рассмотреть и зарисовать образовавшийся каллус.

Р а б о т а 6. Пассирование каллусной ткани

 на свежую питательную среду

Материалы и оборудование: культура каллусной ткани, чашки Петри со стерильной агаризованной средой, стерильные пинцеты, стерильные скальпели, спиртовая горелка, спички, стерильные чашки Петри, 96%-ный спирт.

Объяснение. Кривая роста каллусной ткани носит S-образный характер. Она состоит из следующих фаз: начальной лаг-фазы, фазы логарифмического роста, во время которой идет активное деление клеток, фазы замедленного роста, стационарной фазы и фазы деградации. Для того чтобы сохранить способность к делению и дальнейшему росту, кусочек каллусной ткани переносят на свежую питательную среду. Этот прием поддержания клеточных делений носит название пассирования каллусных тканей. Пассировать каллусную ткань можно неограниченное число раз. Однако при многократном его повторении возможно "привыкание", которое выражается в приобретении автономности по отношению к экзогенным гормонам и утрате или значительному ослаблению способности каллусных клеток к регенерации целого растения.

Ход работы. Перенести, соблюдая строгую стерильность, каллус в стерильную чашку Петри. Отделить некротизированные участки и кусочки старой агаризованной среды. Затем каллусную ткань разделить на равные части и асептически перенести в чашки Петри со стерильной питательной средой. Чашки Петри поместить в термостат с температурой 25^оС и влажностью 60% на 3–4 недели. В конце этого срока пронаблюдать и зарисовать каллусную ткань.

Р а б о т а 7.  КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ИЗОЛИРОВАННЫХ