Становление энзимологии как науки

История науки - это история идей, которые изменили мир, но которые сначала были осмеяны и oтвергнуты. (Р. Брэдберu)

История открытия и исследования ферментов весьма интересна и поучительна. Вопросы о том, что же собой представляют живые системы, какова природа процессов в живом, каковы химические основы наблюдаемых превращений вещества, волновали всех великих химиков XIX столетия. Современная химия многим обязана Йенсону Якобу Берцелиусу (1779-1848). Он в рамках атомистической теории Дальтона создал первую таблицу атомных масс, разработал номенклатуру соединений и ycoвершенствовал химическую символику, создал химический язык, которым мы пользуемся в настоящее время. Й. Берцелиус создал электрохимическую теорию химических реакций, ввел представление об изомерии, открыл ряд новых элементов, таких как цeзий, селен, торий, ванадий. Им же былo введено в химию понятие катализа. К этому времени уже накопилось мнoго необъяснимых фактов, обнаруживающих влияние «тpeтьего тела» на протекание химической реакции. В 1812 г. Ф. Фогель продемонстрировал, что в присутствии угля происходит реакция водорода и кислорода. В 1817 г. Генри Дэви (1778-1829) экспериментально показал, что в присутствии металлической платины или палладия происходит медленное гopeние водорода, монооксида yглерода, метана, паров спирта, эфира. Это были «химические фокусы». Дэви демонстрировал, что при внесении в колбу, содержащую пары спирта или эфира, нагретой платиновой проволоки, часть проволоки, нaxoдящаяся в колбе, раскалялась докрасна и оставалась в таком состоянии, пока в колбе было достаточное количество пара и воздуха. В это время уже были хорошо известны опыты Кирхгофа (1811, 1814 ) по гидролизу крахмала под действием разбавленной серной кислоты и некоего «клейковатого вещества», выделяемого из пшеницы. Й. Берцелиус был первым, кто осознал значимость влияния «третьего тела». Он использовал данные опытов К. Кирхгофа при построении своей концепции о катализе*. В 1836 г. в статье «Некоторые соображения о до сих пор еще не познанной силе, действующей при образовании органических соединений в живой природе» Й. Берцелиус писал: «Сущность "каталитической силы" состоит в том, что тело лишь своим присутствием, а не благодаря химическому сродству, не проявляющемуся при этой температуре, может возбуждать дремлющие химические сродства взаимодействующих веществ». С caмого начала развития представлений о катализе было ясно, что в биологических системах ускорение реакций под действием катализаторов играет первостепенную роль. Й. Берцелиус писал: «В живых растениях и животных, в тканях и жидкостях протекают тысячи каталuтuческuх процессов, осуществляя большое количество различных химических синтезов из общего исходного материала». Это была гениальная догадка. (Из школьной характеристики Й. Берцелиуса: «У мальчика хорошие способности. но плохое поведение. Eгo будущее сомнительно». В современном смысле понятие «катализ» вошло в химию лишь спустя полвека после смерти Й. Берцелиуса благодаря работам Вильгельма Оствальда (1853-1932). Были сформулированы основные понятия о скорости химических реакций, установлены зависимости скорости реакции от концентраций взаимодействующих веществ (Якоб Вантгофф (l852-1911) «Очерки по химической динамике» (1884 Нобелевская премия по химии 1901 за открытие законов химической кинетики и осмотическоrо давления), прежде чем понятие о катализе прочно вошло в категорию фундаментальных представлений химии. В. Оствальд определил катализатор как вещество, «которое, не входя в конечный продукт химической реакции, увеличивает ее скорость».

* Термин «катализ" впервые был использован алхимиком Андреасом Либавием (I550- 1616), однако он не придавал ему смысла, определенного Берцелиусом.

Соответственно катализ представляет собой «ускорение медленно протекающих химических процессов в присутствии посторонних веществ». В 1901 г. В. Оствальд писал, что он различает четыре типа катализаторов: контактное действие «зародышей», гомогенный катализ, гетерогенный катализ и действие ферментов. В 1909 г. В. Оствальду была присуждена Нобелевская премия по химии за работы по катализу и основополаrающие исследования скоростей химических реакций. Таким образом, основоположники тeoрии катализа изначальна рассматривали ферментативный катализ как неотъемлемую составную часть катализа в целом. Представления о том, что катализ в живых системах осуществляют химические вещества, также имеют свою историю. Впервые каталитическое действие биоматериала было обнаружена Константином Сигизмундовичем Кирхгофом (l764 - 1833). К. Кирхгоф (аптекарь и химик по образованию) занимался проблемой получения сахара из крахмала*. В это время он работал в главной аптеке Caнкт- Петербурга. К. Кирхгоф понимал, что caхар и крахмал являются химически родственными соединениями. В 1811 г. он представил в Академию наук образцы caxapногo сиропа и кристаллическоrо «сахара», полученные им путем гидролиза картофельноrо крахмала под действием разбавленной серной кислоты. Реакция протекала сутки, при этом серная кислота не pacходовалась и по завершении процесса нейтрализовалась расчетным количеством карбоната кальция. Это был истинно каталитический процесс. В 1812 г. К. Кирхгофом были изложены основы этого процесса в статье «О приготовлении сахара из крахмала». Расширяя свои исследования, К. Кирхгоф обнаружил, что аналоrичноrо результата можно добиться и без добавления кислоты, а под действием «клейковатоrо вещества» (клейковины), которое он получил из пшеничноrо зерна. 30 ноября 1814 г. К. Кирxгоф выступил с докладом «О получении сахара при осолаживании злаков». Впервые было показано, что aгентом, обеспечивающим гидролиз, является отличное от крахмала «клейковатое вещество». Работая в России, К. Кирхгоф провел большое число исследований в области технической химии.

*Проблема rидролитическоrо расщепления различноrо уrлеводноrо сырья не потеряла cвoeгo значения и сеrодня. В середине 1960-x гг. она вышла на технолологический уровень, и сейчас создана мощная индустрия ферментативноrо получения сахаров путем гидролиза крахмала под действием глюкоамилаз.

В 1812 г. он был избран экстраординарным академиком Петербургской академии наук, был членам Падуанской и Бостонской академий. Все великие химики первой половины XIX в. участвовали в дискуссии о природе процессов, происходящих в живых системах. В качестве модели и главноrо объекта анализа и дискуссии pacсматривался процесс конверсии сахара в спирт или уксусную кислоту (винное или уксуснокислое брожение). Парижская академия наук в 1799 г. задала конкурсный вопрос: «Чем отличаются растительные и животные вещества, действующие как фермент*, от тех веществ, которые подвергаются ферментации». Обоснованный ответ на этот вопрос был дан французским исследователем Шарлем Каньяр-Латуром (Ш. Каньяр де ла Тур) (1777 - 1859). Он экспериментально показал, что дрожжи, осуществляющие ферментацию, - не просто химические вещества, а живые организмы, способные расти и размножаться, причем исходные вещества и продукты реакции ­ простые химические coединения. Этот вывод был встречен в штыки Берцелиусом, Ю.Либихом, Ф. Вёлером. Вклад Юстуса фон Либиха (1803-1873) в развитие органической химии и агpохимии сравним лишь со значением работ Й. Берцелиуса для общей и неорганической химии. Ю.Либихом создана теория рaдикалов, разработаны методы анализа и впервые осуществлен синтез многих органических соединений, показана роль фосфора I и азота в развитии растений, впервые использованы минеральные удобрения - суперфосфат и сульфат аммония для повышения плодородия почв.

Великий Ю.Либих в школе имел много проблем. Он увлекался химией и пренебрегал традиционными школьными предметами. Отец устроил eгo практикантом в аптеку. Но Юстус больше интересовался химическими экспериментами, чем производством лекарств. Опасные опыты с серебром и ртутью он проводил тайно. Опыты закончились сильным взрывом, взлетела на воздух крыша аптеки. На этом карьера Либиха - аптекаря закончилась.

Фридрих Вёлер (1800 - 1882) знаменит прежде вceгo своими работами по получению мочевины и щавелевой кислоты (простейших органических соединений) из неорганических веществ. Им также впервые получен в значительных количествах металлический алюминий, открыта практически важная реакция получения ацетилена из карбида кальция.

Ф. Вёлер так описал лабораторию Й. Берцелиуса, в которой были сделаны выдающиеся научные открытия: «Рядом с жилым помещением находились две очень скромно оборудованные комнаты. Там не было газа и воды. В одной комнате стоял обычный деревянный стол, у стены - несколько маленьких шкафов с небольшим количеством peaгентов. Канализационную систему заменяли сосуд с водой, фаянсовая раковина и стоящие внизу ведра. Во второй комнате находились весы и другие инструменты и мастерская с маленьким токарным станком. На кухне выполняла свои служебные обязанности Анна, которая была служанкой и лаборанткой великого ученого. Там же стояла маленькая печь и постоянно горячая песочная баня». При этом И. Берцелиус утверждал, что хороший химик должен уметь просверлить отверстия пилой.

Й. Берцелиус, Ю.Либих и Ф. Вёлер представляли себе процесс брожения как истинный химический процесс, в котором осадок (дрожжи) обладает некоторой химической активностью. Фактически вопрос сводится к тому, что же представляет собой катализатор: химическое вещество неизвестной, возможно, очень сложной структуры или живой микроорганизм? Ю.Либих, Й. Берцелиус, Ф. Вёлер и многие дрyгие химики не могли воспринять идею о том, что живые организмы при брожении осуществляют химическую реакцию, несмотря на то что поток фактов, подтверждающих это, непрерывно рос.

Однажды у Анны, которая была служанкой Й. Берцелиуса, журналисты спросили, как работает ее шеф и что он делает весь день. Служанка ответила, что рано утром она приносит ему различные порошки, жидкости и другие химические вещества.

­ Что он делает со всем этим? - спросили журналисты.

­ Он смешивает все в большом сосуде.

­ Что дальше?

­ Затем нагревает смесь и переливает в другую посуду.

­ А что в конце?

­ В конце он выливает все в ведро, на следующий день начинает все сначала.

История открытия и исследования ферментов весьма интересна. Вопросы о том, какова природа процессов в живом, каковы химические основы наблюдаемых превращений вещества, волновали всех великих химиков XIX столетия. Бурная дискуссия о природе химических реакций в живом развернулась между Луи Пастером (1822-1895), Юстусом фон Либихом и Марселеном Бертло (1827 - 1907). Луи Пастер был ярым сторонником тoгo, что брожение (т. е. конверсию сахара в спирт или в уксусную кислоту и сопутствующие продукты) могyт осуществить лишь живые клетки микроорганизмов. Л. Пастер отвергал саму идею необходимости существования растворимых ферментов, участвующих в брожении. Он писал: «Я не вижу никакой необходимости ни в существовании этих ферментов, ни в полезности их функционирования при брожении».

Отметим, что Ю.Либих, проводя различные химические реакции с органическими молекулами, не мог допустить мысли, что для реализации простого химического процесса - окисления спирта в уксусную кислоту (реакция идет под действием различных химических окислителей) - необходимо участие такого сложного агрегата, как целая клетка живого микроба. Ю.Либих предполагал, что наблюдается всего лишь корреляция между «физиологическим процессом» образования продуктов и ростом клеток.

Значительную роль в выяснении вопроса сыграла дискуссия между Л. Пастером и Марселеном Бертло. М. Бертло полагал, что процесс брожения осуществляется органической субстанцией дрожжей. Важным был эксперимент М. Бертло, в котором он разрушил клетки дрожжей, получил бесклеточный экстракт, переосадил eгo спиртом без существенной потери активности и доказал, что полученная субстанция обладает каталитическими свойствами. Этот эксперимент показал, что «фермент» и живые клетки микроорганизмов не одно и то же, продемонстрировал, что клетки содержат вещества, реально осуществляющие химическую реакцию. В конечном счёте Ю.Либих оказался прав. Известно, что конверсию этанола в уксусную кислоту осуществляют два фермента - алкогольдегидрогеназа и ацетальдегидрогеназа.

На то, что брожение имеет характер каталитическоrо процесса, указывал Эйхальд Митчерлих (1794-1863). В 1843 г. он отмечал, что для проведения процесса сбраживания сахара необходимо незначительное количество дрожжей (менее 1 %), несоизмеримое с количеством конвертированноrо субстрата, т. е. вкладом дрожжей как вещества в материальный баланс реакции можно пренебречь. Дискуссия закончилась, но участники остались при своем мнении. Необходимо отметить: авторитет Л. Пастера был настолько высок, что eгo мнение, что лишь живые клетки микроорганизмов являются носителями процессов конверсии вещества, господствовала среди микробиологов длительное время. Eгo влияние на исследователей ощущалось и в ХХ в. Особую роль в дискуссии сыграла неоднозначность в терминах, существовавшая в те годы. В течение многих лет дрожжи называли ферментом. Л. Пастер был против распространения термина «фермент» на растворимые вещества, способные проводить конверсию caхара, а понимал под «ферментом» живые растущие клетки, осуществляющие образование этиленового спирта и СО₂ . Термины «энзим» и «энзимология» были ввeдeны в 1876 г. В. Кюном для обозначения «неорганизованных», «бесформенных» ферментов, таких как диастаза, пепсин, трипсин, известных уже тoгдa. Точку в этом историческом споре поставили опыты Э. Бухнера (1897 г.), который продемонстрировал возможность проведения процесса брожения под действием бесклеточных экстрактов. Э. Бухнер механически разрушал клетки дрожжей, наблюдая за процессом под микроскопом, проводил экстракцию водой с отделением жидкости от твердых частиц фильтрованием под высоким давлением. Полученный раствор смеси ферментов был способен к интенсивному выделению спирта и СО₂ при введении ero в раствор caxapoзы. На реакцию не действовали классические антисептики. Опыты показали, что брожение - результат действия ферментов, не зависящеrо от целостности клетки. В 1907 г. Э. Бухнеру была присуждена Нобелевская премия по химии. Результатом работы большой гpуппы исследователей, начиная с К. Кирхгофа, И. Берцелиуса, заканчивая В. Оствальдом и Э. Бухнером, явилось утверждение, что ферменты - это химические катализаторы и необходимо искать объяснения действия ферментов на химической основе.

Таким образом, стало ясно следующее. Химический катализ и биологический катализ - это явления одного порядка; катализаторы, «третье тело» обладают общим свойством - они способны ускорять химические реакции. При этом существуют как общие катализаторы, способные ускорять многие реакции (например, кислоты), так и специфические катализаторы, ускоряющие лишь узкий кpyг реакций и работающие с ограниченным набором субстратов. Последнее свойство xapaктерно для ферментов.

В клетках микроорганизмов, растений, животных, человека имеются вещества, обладающие исключительно высокой каталитической активностью. Биологические катализаторы способны ускорять как простейшие химические реакции (инверсию сахара, гидролиз белков, реакции окисления), так и сложные процессы, такие как диспропорцианирование сахара в этанол и СО₂.

Важным результатом была демонстрация тогo факта, что биокаталитической функцией обладают белки. Наиболее четко это было сформулировано немецким исследователем М. Траубе. В 1858 г. он в рамках cвоегo представления о действии ферментов oxapaктeризовал ферменты как химические вещества белковой природы. Этому предшествовал этап накопления экспериментальных фактов. В 1830 г. П. Робике и А. Бутрон-Шаляр исследовали гидролиз аминдалина под действием измельченноrо rорькоrо миндаля. В 1831 г. Э. Лейксом было обнаружено, что слюна обладает активностью диастазы. Впервые достаточно очищенный препарат фермента yдaлось получить А. Пайену и Ж. Персу в 1833 г. Они выделили амилазу из солода, осадив ферментный препарат спиртом. Аналогичными методами удалось получить ферментный препарат синигpиназы (Ж. Форс, 1835 г.), пепсина (Т. Шванн, 1836 г.), трипсина

(Л. Корвизар, 1857 г.). Заметную роль в развитии методологии выделения ферментов сыграли работы Э. Брюкке и А.Я.Данилевскoгo, которые использовали явление aдсорбции для разделения белков. В 1862 г. А. Я. Данилевскому впервые удалось разделить трипсин и панкреатическую амилазу. Эти работы стали основой современных методов получения белков.

Следующий этап исследования ферментов связан с осознанием тогo факта, что ферменты обладают способностью взаимодействовать лишь с избранными субстратами, т. е. обладают специфичностью. Также было доказано, что субстрат в процессе каталитической реакции образует лабильный комплекс с белком. Детальное исследование ряда систем позволило Эмилю Фишеру (l852 - 1919) сформулировать представления о специфичности ферментативноrо катализа. Э. Фишер - выдающийся химик - органик. Он занимался изучением природы белков, сахаров, красителей, азотистых, ocнований, дубильных веществ. Э. Фишер гидролитически расщепил белки и показал, что все белки построены из α-аминокислот. Ряд аминокислот он получил встречным синтезом.

Э. Фишер происходил из бoгатой купеческой семьи, и отец хотел, чтобы Эмиль пошел по ею стопам. Эмиля отдали на практику к родственнику, но eгo совершенно не интересовала торговля. Через некоторое время родственник заявил, что из негo ничего не получится. В конце концов отец Эмиля отказался от этой идеи и вынес приговор: «Жаль, что для купца он слишком глуп. Пусть лучше изучает химию».

Э. Фишер синтезировал дипептиды и олиrопептиды. В 1907 г. им синтезирован пептид, состоящий из восемнадцати различных аминокислот. В 1894 г. Э. Фишер начал цикл работ по изучению специфичности действия ферментов. Эти работы были продолжением ero исследований структуры сахаров и пептидов. Для объяснения специфичности действия ферментов Э. Фишер сформулировал положение о том, что субстрат подходит к ферменту, как ключ к замку. Это положение не потеряло актуальности и сегодня лежит в основе представлений о стерическом соответствии между субстратом и ферментом. Выдающиеся работы были выполнены Э. Фишером в области химии yглеводов и красителей. Работы Э. Фишера заложили основы изучения нуклеиновых кислот. За исследования сахаров и пуриновых производных в 1902 г. Э. Фишер был удостоен Нобелевской премии по химии. То, что фермент взаимодействует с субстратом и образует фермент-субстратный комплекс, следовало из анализа кинетики каталитической реакции. Изучение кинетических закономерностей действия ферментов начиналось на этапе развития химической кинетики.

Впервые скорость ферментативных peакций анализировал Тамман. Он провел тщательное сравнительное исследование действия ферментов и химических катализаторов реакции гидролиза и показал, что ферментативный гидролиз rликозидов или сахаридов аналогичен классическому кислотному, исследуемому со времен К. Кирxrофа. Тамман впервые изучил температурные зависимости скорости ферментативной реакции. Результаты работы были опубликованы в 1892 г. в журнале pyccкoro физико-химическоrо общества и впоследствии в журнале физической химии, издаваемом Я. Baнтгоффом и В. Оствальдом. Завершенную форму химико-кинетические исследования приобрели в работах Луи Анри (l834 - 1913) и Леона Михаэлиса (1875 - 1949). Из кинетических данных однозначно следовало, что в процессе каталитического действия фермент образует комплекс с субстратом. Интерпретация Л. Анри и Л. Михаэлисом роли этого комплекса была различной (см. rл. 4), однако оба подхода для объяснения экспериментальных данных постулировали образование фермент-субстратноrо комплекса.

Значительный вклад в фундамент кинетики ферментативного катализа внесли работы Э. Армстронга (1904 г.), обнаружившего эффекты ингибирования ферментативных реакций аналогами субстрата, и С. Соренсена (1868 - 1939), продемонстрировавшего зависимость скоростей ферментативных реакций от концентрации ионов водорода.

Мудрее Bceгo - время, ибо оно раскрывает все. Фалес

История открытия ферментов и первых исследований биокатализаторов интересна и поучительна. Практически все великие химики XIX столетия внесли свой вклад в создание фундамента химической энзимологии, их привлекал феномен биологическоrо катализа. Работая в различных областях химии (общая и неорганическая химия, органическая химия, физическая химия), каждый сформировал свое понимание этой загадки природы. Общий междисциплинарный характер химической энзимологии сохраняется и сеrодня. Многие положения, сформулированные исследователями в XIX в., предметы споров, мнения и выводы сегодня могут показаться очевидными и в чем-то наивными. Однако это кажущаяся простота. Каждый шаг вперед- это шаг в неизвестное. Таков тepнистый путь постижения истины. Двадцатый век внес многo новогo в понимание феномена биолоrическоrо катализа. Новые физико-химические методы исследования качественно изменили облик химической энзимологии. Методы молекулярной биологии и генетической инженерии многoe прояснили в механизмах реакций и позволили получать новые биокатализаторы, не существующие в природе. В ΧΧ в. в науку пришло мнoгo исследователей, что способствовало резкому количественному и качественному росту знаний. Наконец, появились методы работы с большими объемами информации и проведения вычислений гигантских объемов. Как многие области химии, химическая энзимолоrия стала разделом технической химии. Все это создает качественно новый уровень понимания проблемы. Тем не менее сегодня мы не можем утверждать, что до конца понимаем феномен биологическоrо катализа. Непонятно, каким образом возникли биологические катализаторы, обладающие фантастической активностью, как они эволюционируют, не ясны детали многих ферментативных реакций, не до конца изучены механизмы регyляции активности ферментов и механизмы peгyляции их экспрессии, не вceгдa однозначно прослеживается связь каталитической активности фермента с физиологическими откликами клетки. Самым непонятным и интригyющим остается вопрос о происхождении биокатализаторов и биологических систем в целом.