МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИСЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

Молекулярно-генетическиеметоды. Относятся к числу наиболее сложных и вместе с тем наиболее точных методов диагностики моногенных болезней. Эти методы можно использовать как в пре-натальной, так и в постнатальной диагностике заболеваний.

Материалом для диагностики на молекулярном уровне наслед­ственной патологии служат молекулы ДНК, выделенные из лю­бых клеток исследуемого организма, содержащих ядра. Чаще всего для этого используют лейкоциты крови, а в случае пренатальной диагностики — также клетки амниотической жидкости и ворсин хориона. В дальнейшем анализируют особенности структурной организации того или иного гена, имеющегося в составе выде­ленной ДНК, который может иметь отношение к соответствую­щему заболеванию.

В настоящее время молекулярно-генетические исследования че­ловека значительно облегчены в связи с тем, что практически за­вершено молекулярное клонирование его генома. С помощью ген­но-инженерных технологий из ДНК всех хромосом, а также из митохондриальной ДНК выделены фрагменты, содержащие локу-сы отдельных генов, которые были затем включены в состав век­торных молекул (небольших кольцевых молекул ДНК вирусов либо бактериальных плазмид). Созданные таким образом обширные «биб­лиотеки» клонированных генов человека (клонотеки) используют как при проведении исследовательских работ, так и для решения практических задач молекулярной диагностики генных болезней. При этом становится возможным определение нуклеотидной последо­вательности (секвенирование) любого гена человека.

После расшифровки нуклеотидной последовательности того или иного гена и прилегающих к нему с двух разных сторон (фланки­рующих) участков ДНК появляется возможность копирования (амплификации) этого гена в искусственных (лабораторных) ус­ловиях с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Эта ре­акция основана на принципе естественной репликации ДНК в клетке, но осуществляется в специальном приборе (автоматичес­ком термоциклере), работа которого контролируется компьютер­ной программой. Для постановки ПЦР можно использовать от­дельные фрагменты ДНК или всю ДНК из клеток исследуемого индивидуума, содержащую анализируемый ген. Результатом мно­гократно повторенных циклов реакции будет искусственный син­тез большого числа копий ДНК исследуемого гена, которая будет подвергнута дальнейшему анализу. Наиболее точная диагностика возникшего нарушения в копированной ДНК мутантного гена достигается при определении ее нуклеотидной последовательнос­ти (секвенировании гена). Однако, несмотря на разработку авто­матизированных процедур секвенирования, этот метод остается дорогостоящим и еще не получил достаточно широкого примене­ния в диагностике генных болезней.

На основе геномной клонотеки человека или индивидуальных генных копий можно создать так называемый молекулярный зонд, т. е. препарат однонитевой ДНК нормального или мутантного гена (либо комплементарный ей фрагмент РНК), который содержит радиоактивную метку (например, тимин или урацил, меченный ³²Р). Такие зонды используют для идентификации нормальных или мутантных генов, находящихся в молекулах ДНК исследуемого организма, в тестах ДНК-ДНК-гибридизации (либо РНК-ДНК-гибридизации). В настоящее время используют различные моди­фикации первоначального метода гибридизации ДНК, известно­го как блот-гибридизация по Саузерну.

В некоторых случаях молекулярная диагностика генной патоло­гии может проводиться также с использованием ферментов, спе­цифически разрезающих молекулы ДНК, которые называют рес-триктазами. В качестве примера можно ознакомиться с действи­ем рестриктазы EcoRl, которая способна «узнавать» лишь те уча­стки (сайты) молекулы ДНК, которые содержат шестинуклео-тидные инвертированные последовательности — 5'-ГААТТЦ-3' на одной нити и 3'-ЦТТААГ-5' на другой (комплементарной) нити. Далее эта рестриктаза вносит разрывы между нук-леотидами Г и А каждой из нитей молекулы с их последующим разделением. В результате молекула окажется разрезанной во всех сайтах, имеющих указанную специфическую последовательность из шести пар нуклеотидов.

После обработки той или иной рестриктазой молекула ДНК распадается на определенное (специфическое для каждой молеку­лы и соответствующей рестриктазы) число линейных фрагментов, которые можно разделить с помощью электрофореза и проанали­зировать с использованием специального окрашивания. В тех случа­ях, когда мутационное изменение какого-либо гена затрагивает нуклеотидную последовательность, «узнаваемую» рестриктазой (сайт рестрикции), наблюдается нару­шение нормального полимор­физма длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ), т.е. имеет место изменчивость по размерам фрагментов исследуемой ДНК при ее обработке соответствую­щей рестриктазой.

Если в результате мутации внутри гена исчезает имевший­ся сайт рестрикции или появля­ется новый сайт там, где его ра­нее не было, то это приводит к увеличению длины соответствующего рестрикционного фрагмента либо, наоборот, к возникно­вению двух новых фрагментов с меньшими размерами, чем у пер­воначального фрагмента, существовавшего до возникновения му­тации. Эти изменения можно выявить при сравнительном ПДРФ-анализе ДНК нормального и мутантного аллелей исследуемого гена, которую предварительно копируют с помощью ПЦР. При этом может быть получена информация не только о характере мутаци­онного изменения, но и о гомозиготном или гетерозиготном со­стоянии организма по соответствующим аллелям. При ПДРФ-ана-лизе с использованием большого фрагмента ДНК, содержащего нужный ген, либо всей геномной ДНК после обработки препарата выбранной рестриктазой возникает огромное число рестрикцион­ных фрагментов. В этом случае необходимо проводить маркирова­ние анализируемого участка ДНК с помощью соответствующего молекулярного зонда (методом блот-гибридизации по Саузерну).

В настоящее время ДНК-диагностика в достаточно полном объеме проводится в Федеральных генетических центрах России (на базах лаборатории пренатальной диагностики НИИАГ им. Д.О.Отта РАМН, Санкт-Петербург, и лаборатории ДНК-диагностики МГНЦ РАМН, Москва) и является вполне реальной для следующих мо­ногенных заболеваний человека: 1) муковисцидоз; 2) миодистро-фия Дюшенна; 3) гемофилия А и В; 4) синдром ломкой Х-хромо-сомы; 5) фенилкетонурия; 6) миотоническая дистрофия; 7) ад-реногенитальный синдром; 8) спинальная амиотрофия Вердни-га—Гоффмана; 9) болезнь Вильсона—Коновалова; 10) атаксия Фридрейха; 11) синдром Альпорта; 12) болезнь Шарко —Мари— Туе; 13) болезнь Виллебранта; 14) хорея Гентингтона; 15) бо­лезнь Леша—Нихана; 16) семейная гиперхолестеринемия и др.

Общая цель: усвоить основные принципы применения лабора­торных методов для диагностики и прогнозирования наследствен­ных болезней человека; ознакомиться с отдельными лаборатор­ными методами, используемыми в диагностике наследственной патологии.