Опыт 3. Количественное определение общего холестерина в сыворотке крови прямым методом по реакции Златкис – Зака

Лабораторная работа «Холестерин»

Цели и задачи: изучить основные функции и пути обмена холестерина в организме, провести определение содержания общего холестерина в сыворотке крови.

Студент должен:

- знать: химическую природу и строение холестерина, содержание холестеина в тканях, функции холестерина в организме, сущность понятий «гиперхолестеринемия» и «гипохолестеринемия»;

- уметь: проводить выделение липидов из тканей, осуществлять их идентификацию химическими методами, количественно определять концентрацию общего холестерина в сыворотке крови прямым методом по реакции Златкис – Зака, пользоваться калибровочным графиком;

- владеть: методикой проведения экстракции, приемами работы с фотоэлектроколориметром, методикой сбора и анализа данных эксперимента.

Оборудование и реактивы: пробирки, мерные цилиндры, пипетки аналитические, колба круглодонная, обратный холодильник, воронки, фильтровальная бумага, фотоэлектроколориметр, мозг, гипс, хлороформ, этанол, концентрированная серная кислота, уксусный ангидрид, смесь формалина с концентрированной серной кислотой, насыщенный спиртовой раствор хлорида кадмия, сыворотка крови, ледяная уксусная кислота, рабочий раствор хлорида железа, стандартный раствор холестерина.

Опыт 1. Выделение холестерина из тканей головного мозга.

Тщательно растирают в ступке 5 г мозга и 10 г гипса. Полученную массу намазывают на стеклянную пластину и сушат в сушильном шкафу при 60⁰С. Сухую массу счищают с пластинки и растирают в ступке. Переносят в сухую пробирку, приливают 6 мл хлороформа, взбалтывают 10 минут. Экстракт отфильтровывают в сухую пробирку.

Опыт 2. Качественные реакции на холестерин.

Реакция Шиффа.

В пробирку наливают 1 мл хлороформного раствора холестерина и осторожно по стенке подслаивают 1 мл концентрированной серной кислоты. На границе раздела жидкостей появляется кольцо красного цвета.

Реакция Сальковского.

Жидкость после проведения пробы Шиффа встряхивают. После расслаивания верхний слой окрашивается в красный цвет, нижний имеет желто-оранжевую окраску с зеленой флуоресценцией.

Реакция Либермана – Бурхарда.

В пробирку наливают 1 мл хлороформного раствора холестерина, добавляют 0,5 мл уксусного ангидрида и 2 капли концентрированной серной кислоты. Хорошо перемешивают. Образуется красная окраска, переходящая в фиолетовую, затем синюю и зеленую. При незначительном содержании холестерина может сразу появиться зеленая окраска.

Реакция Витта.

К 2 мл хлороформного раствора холестерина приливают равный объем смеси формалина с серной кислотой и взбалтывают. Образуется 2 слоя: верхний – вишневого цвета и нижний – буро-красный с интенсивной зеленой флуоресценцией. Сливают верхний (хлороформный) слой в другую пробирку и добавляют 2-3 капли уксусного ангидрида. Окраска переходит в синюю.

Цветные реакции на холестерин обусловлены дегидратацией и окислением холестерина под действием концентрированной серной кислоты и последующей конденсацией продуктов с образованием соединений с сопряженными двойными связями, дающими с серной кислотой различные окрашенные производные.

Опыт 3. Количественное определение общего холестерина в сыворотке крови прямым методом по реакции Златкис – Зака.

Метод основан на реакции холестерина с уксусной и серной кислотами в присутствии хлорида железа. Вероятно, происходит дегидратация холестерина и его окисление.

К 0,1 мл сыворотки крови прибавляют 3 мл ледяной уксусной кислоты и 2 мл рабочего раствора хлорида железа, перемешивают. Готовят контроль: к 0,1 мл дистиллированной воды прибавляют 3 мл ледяной уксусной кислоты и 2 мл рабочего раствора хлорида железа. Оставляют на 15 минут.

Колориметрируют против контроля на фотоэлектроколориметре при длине волны 510-560 нм (зеленый светофильтр) в кювете с толщиной слоя 1 см.

Из стандартного раствора холестерина готовят разведения, как указано в таблице.

Таблица.

Через 20 минут пробы фотометрируют против контроля. По результатам строят калибровочный график. По калибровочному графику определяют содержание холестерина в сыворотке крови. Норма содержания холестерина в сыворотке крови – 120-250 мг% (3,12-6,50 ммоль/л).