Приготовление абсолютного спирта

Для фиксации и обезвоживания применяется абсолютный спирт, однако его не всегда легко приобрести. В таком случае его приходится готовить в лабораторных условиях, пользуясь при этом прокаленным (безводным) медным купоросом (см. ниже).

Для приготовления абсолютного спирта прокаленный белый купорос насыпают в большую широкогорлую банку и заливают 96°-м спиртом из такого расчета, чтобы столб спирта над купоросом превышал толщину слоя последнего не больше чем в 4-5 раз. Содержимое банки ежедневно взбалтывают в течение 4-5 дней, добиваясь посинения всей толщины оседающего купороса. После этого в банку подсыпают еще порцию белого купороса, но уже в меньшем количестве, примерно в 2-3 раза, и оставляют на 1-2 дня. Подсыпания купороса повторяют до тех пор, пока последняя порция его не перестанет синеть; тогда абсолютный спирт считается готовым. Такой абсолютный спирт храниться постоянно на медном купоросе и используется по мере надобности для различных целей.

Приготовление безводного купороса.

Берут химически чистый синий купорос (если он крупнокристаллический, то его предварительно толкут в фарфоровой ступке) и прокаливают в фарфоровой чашке. В результате прокаливания происходит удаление кристаллизационной воды из молекулы медного купороса и получается безводный купорос белого цвета. При соприкосновении с водой он вновь жадно поглощает воду и дает первоначальное соединение синего цвета, на чем и основано его применение для обезвоживания спирта.

Прокаливание ведут с соблюдением известных предосторожностей, а именно: мелко размельченный купорос небольшими порциями прокаливают на малом огне через асбестовую сетку в фарфоровой чашке (или медной посуде, при постоянном помешивании фарфоровой или стеклянной лопаткой). Нельзя пользоваться металлическим шпателем и вести прокаливание в железной или никелированной посуде. Несоблюдение указанных правил может привести к пережиганию, точнее к разложению медного купороса с образованием окислов меди. Последнее обстоятельство весьма неблагоприятно сказывается на способности купороса поглощать воду.

Хорошо и осторожно прокаленный медный купорос должен быть совершенно белым или слегка голубоватым. При перекаливании он приобретает серый цвет. Очень хорошо вести прокаливание купороса на электрической плитке малой мощности или в термостате (мелко растолченный купорос рассыпают тонким слоем на картоне). Прокаливание в термостате при 600° - 700° идет медленно, около 3-х недель (при ежедневном перемешивании), а при температуре 1000° – в течение 1-2 дней.

При прокаливании медный купорос начинает отдавать кристаллизационную воду уже при температуре 600°, а при 1000° частично разлагается и становиться серым.

Прокаленный купорос хранят в банке с притертой крышкой.

Ацетон

Ацетон – жидкость с характерным запахом, смешивается с водой, хлороформом, ксилолом, им пользуются. В качестве быстрого фиксирующего средства в тех случаях, когда необходимо срочное исследование. Однако следует иметь в виду, что ацетон сильно сморщивает ткани, затрудняя этим микроскопическое исследование. Для фиксации берут маленькие кусочки. Фиксация кусочков толщиной 2-3 мм. Требует примерно около 2-3 часов. Фиксируют в двух порциях. Заливают в парафин. Лучшие результаты дает ацетон в комбинации с другими фиксирующими средствами. Пригоден только бесцветный и безводный ацетон, хорошо смешивающийся с водой.

Негоден желтый технический ацетон, который при смешивании с водой дает мутную смесь.

Сложные фиксирующие жидкости

Жидкость Карнуа

Из числа сложных фиксирующих жидкостей наибольшее практическое значение в работе патологоанатомического отделения имеет жидкость Карнуа.

Состав жидкости: спирт абсолютный – 60 мл, хлороформ – 30 мл, уксусная ледяная кислота – 10 мл.

Очень хороший фиксатор. Имеет особые показания в тех случаях, когда надо спешить с исследованием. Кусочки, толщиной от 2 до 4 мм, фиксируют в ней от 2 до 3-4 часов. Нельзя задерживать объекты в этой жидкости больше, чем это необходимо для их полной фиксации, затем их переносят в 960 спирт и заливают.

Промывка

Цель промывки – удаление фиксатора или его осадков. В зависимости от использованного фиксатора применяют или проточную воду или спирт. Водопроводной водой промывают в течение 24-48 часов. Воду из крана пускают тонкой струйкой в емкость, в которой находятся кусочки материала.

Обезвоживание

Если материал подлежит заливке в парафин, то следующим после фиксации моментом в его обработке является обезвоживание в спиртах восходящей концентрации.

Обезвоживание в спиртах имеет целью подготовить ткани к пропитыванию парафином.

Для пропитывания парафином такое обезвоживание носит лишь подготовительный характер. Это обстоятельство объясняется тем, что парафин не растворяется в спирте и обезвоженные спиртом кусочки требуют ещё дополнительной обработки, а именно: помещение в такую среду, которая с одной стороны, обладает способностью смешиваться со спиртом, а с другой – является хорошим растворителем парафина. К подобного рода средам относятся: хлороформ, ксилол, толуол, бензол.

Спирт как обезвоживающее средство наиболее удобен и потому больше всего распространен, но он не единственный в этом роде. Можно указать, например, на ацетон, который обладает способностью смешиваться с водой, хлороформом, ксилолом. Фиксированные кусочки могут быть сразу проведены через ацетон и залиты в парафин. Однако рекомендовать такую обработку объектов в повседневной работе нельзя, т. к. ацетон очень сильно деформирует ткани. В своей работе к ацетоновой методике прибегают для обезвоживания женских соскобов.

Помимо подготовки объектов к той или иной заливке, обезвоживание в спиртах сопровождается ещё и уплотнением тканей.

Классически вся процедура обезвоживания материала состоит в проведении его через целый ряд спиртов. Проводка кусочков через спирты совершается в широкогорлых банках емкостью мл с простыми или притертыми пробками. При перекладывании кусочков из одного спирта в другой их осторожно подсушивают между двумя листами фильтровальной бумаги или салфеткой. Такое подсушивание имеет целью экономное расходование спиртов и увеличение срока их обезвоживающей способности.

В банку №1 кусочки поступают после фиксации, а в последующие банки из предыдущих. Особенно тщательно надо следить за состоянием спирта в первой банке и своевременно его менять. Спирт во второй и следующей банках может быть ещё некоторое время использован в качестве предыдущего, Т. е. II перемещаем на место I, II на место II, и т. д.

Вообще надо заметить, что мощность обезвоживающей системы в смысле способности пропустить через себя то или иное количество кусочков зависит во многом от тщательности и аккуратности в работе, Т. е. насколько тонко и аккуратно иссекают кусочки, как подсушивают их перед помещением в спирты, и, наконец, насколько обрабатываемые ткани богаты жирами и жироподобными веществами.

Совершенно негодным считается спирт, в котором образуется облако мути вокруг кусочков на дне банке.

Проба с водой служит хорошим контролем степени насыщенности рабочих спиртов жирами. Если при смешивании (в пробирке) небольшого количества бывшего в употреблении спирта с водой получается сильная муть, то такой спирт подлежит немедленной замене. Для повторного использования допустимы спирты, дающие с водой очень слабое помутнение. Что касается последнего спирта, в котором заканчивается обезвоживание кусочков, то здесь, конечно, надо стремиться к тому, чтобы спирт совершенно не давал никакой мути.

Декальцинация

Кости и патологические обызвествленные ткани фиксируют по общим правилам. После фиксации такие ткани нельзя сразу заливать в обволакивающую среду. Они должны быть предварительно подвергнуты специальной обработке, имеющей целью удаление извести. Процесс извлечения извести из тканей называется декальцинацией.

Декальцинация всегда применяется после фиксации.

Для извлечения известковых солей из тканей предложены различные минеральные (азотная, соляная) и органические (муравьиная, трихлоруксусная, пикриновая и др.) кислоты.

При проведении декальцинации необходимо соблюдать следующие правила:

1. Декальцинации подвергают по возможности небольшие и тонкие куски костной ткани (толщиной до 0,5-1 см.), аккуратно выпиленные из фиксированных объектов. Небольшие кусочки декальцинируются скорее, а это, помимо экономии времени, дает возможность лучше сохранить способность тканей воспринимать окраску, которая ухудшается под влиянием кислоты и тем больше, чем длительнее была обработка кислотой.

2. Объем декальцинирующей жидкости в 25-50 раз должен превосходить объем всех вместе взятых декальцинируемых кусочков.

3. Декальцинируемые объекты должны со всех сторон омываться раствором кислоты, для чего их подвешивают на нитке, закрепляя пробкой и, если кусочков много, завязывают в марлю.

4. Декальцинирующую жидкость меняют каждые 48 часов, и проверяют препаровальной иглой степень декальцинации объектов. Декальцинация идет тем скорее, чем чаще меняется жидкость. Когда кусочек становиться эластичным и мягким и игла легко проходит сквозь ткань, обработка считается законченной.

5. Материал тщательно промывают в проточной воде и подвергают дальнейшей обработке как и другой исследуемый материал.

Для декальцинации можно использовать смесь следующего состава: 50 мл муравьиной кислоты, 40 мл соляной кислоты, 410 мл Н20.

Это объясняется тем, что в чистом виде соляная кислота почти совсем не употребляется, т. к. она резко деформирует клеточные структуры и сильно ослабляет способность тканей воспринимать краску. Достоинством муравьиной кислоты является слабое влияние на окрашиваемость тканей, но применение её в значительной мере ограничено её относительно высокой стоимостью.

Декальцинация обычно ведется при комнатной температуре (около 18-220) и всегда в вытяжном шкафу, в котором следует сохранять и неразведенные кислоты.

Уплотнение

Заливка в парафин

Фиксированные кусочки после обезвоживания в спиртах (или декальцинации) переносят вначале в смесь спирта пополам с хлороформом и затем в чистый хлороформ при t = 370С.

Хлороформ хорошо смешивается со спиртами и в тоже время растворяет парафин, поэтому он и необходим как промежуточная среда между обезвоживанием и собственно заключением. Объекты, обработанные хлороформом, в дальнейшем легко пропитываются парафином.

Хлороформ, как и спирты, время от времени меняют во избежание излишнего насыщения его спиртом и жирами.

Для постепенного и лучшего пропитывания парафином кусочки из хлороформа переносят в расплавленную смесь хлороформа с парафином и оставляют в ней при t = 370С в термостате на 1 час. Смесь хлороформа с парафином готовят из равных объемных частей одного и другого, для чего парафин предварительно растапливают.

Из смеси хлороформа с парафином кусочки перекладывают в расплавленный парафин, который должен быть заранее приготовлен и стоять в термостате, установленным на 2-30 выше точки плавления парафина (примерно 54-550) во избежание излишнего охлаждения парафина при открывании дверцы термостата и перекладывании кусочков. Пропитывание в парафине идет в двух порциях, обозначаемых как первая и вторая. Кусочки вначале помещают в первую емкость на 1 час, затем перекладывают во вторую тоже на 1 час.

Работа в двух порциях парафина вызвана необходимостью как можно полнее освободить объект от хлороформа, примесь которого изменяет пластичность парафина, делая его крошкообразным. Хлороформ остается в первой порции парафина. Первый парафин можно использовать в течение длительного времени, при этом его лучше держать в расплавленном виде (в термостате).

После того, как кусочки пробыли во втором парафине достаточное время, берут специальные коробочки «кораблики» и перекладывают кусочки материала по одному на дно и заливают чистым запасным парафином, который специально держат в термостате в расплавленном состоянии. Оставляют при комнатной температуре.

Когда парафин достаточно затвердеет, его извлекают из формочки. Извлеченный парафин благодаря охлаждению должен быть совершенно однородным (гомогенным). Если в нем обнаруживаются беловатые участки (крошковатые на изломе), то это свидетельствует о наличии в нем остатков промежуточной среды. В таком случае кусочки необходимо залить в новую порцию парафина.

Нарезка препаратов

Микротом

Если заливка произведена правильно и качественно, парафиновые блоки готовят для приготовления тонких срезов, необходимых для исследования под микроскопом, достигается это резкой кусочков на особых приборах, называемых микротомами (Рис. 1.). Подобные приборы обеспечивают получение срезов нужной толщины.

Микротом – это специальное механическое устройство, предназначенное для приготовления гистологических срезов определенной толщины.

В работе часто используется санный микротом (МС-2). Прибор получил название благодаря тому, что нож и механизм подачи с зажимом для блока (объетодержателем) движутся на специальных салазках.

Основные части микротома: станина, механизм микроподачи, механизм подъема, зажим для блоков (объектодержатель), ножевые салазки с ножедержателем.

Станина – массивная, чугунная основа, на которой монтируются все остальные узлы. В верхней части имеется паз для перемещения ножевых салазок, несущих ножедержатель. На боковой поверхности расположены наклонные направляющие для перемещения салазок с механизмом подъема.

Механизм подъема состоит из трехгранной призмы, вставленной в специальную оправу, снабженную винтом для подъема призмы и рукояткой для её закрепления в нужном положении. Оправа в свою очередь прочно прикреплена к салазкам, несущим механизм подъема.

Зажим для блоков (рамочный) состоит из внутренней (предназначенной для укрепления блока) и наружной рамок. Система рукояток и винтов позволяет изменять положение рамок в продольном и поперечном направлениях. От основания зажима отходит штифт, при помощи которого зажим для блоков вставляют в специальное гнездо, имеющееся в трехгранной призме. Фиксирование на нужном уровне производят специальной рукояткой.

Ножевые салазки – массивные устойчивые салазки, снабженные ручкой для передвижения и несущие на себе ножедержатель, которые укрепляют на салазках специальной рукояткой, позволяющей менять горизонтальный угол расположения ножа. Сам же зажим снабжен подвижной цилиндрической втулкой, перемещение которой с помощью рычажка меняет угол наклона ножа.

Механизм микроподачи – наиболее сложный узел микротома. Он состоит из стержня, соединенного жестко с тягой (несущей на своем конце собачку), храповика и микровинта.

Автоматическая микроподача блока осуществляется следующим образом:

при каждом обратном (холостом) ходе ножа ножевые салазки толкают стержень микроподачи и перемещают его. Это в свою очередь вызывает перемещение тяги, которая с помощью собачки поворачивает храповик. Вращение его через конические шестеренки передается микровинту, который через разъемную гайку перемещает по наклонным направляющим снизу- вверх салазки с зажимом для блока.

Система тяга – стержень каждый раз с помощью специальных пружин возвращается в исходное положение. Следовательно, чем больше стержень микроподачи выдвинут навстречу ножевым салазкам, тем большим окажется его шаг (а соответственно, и поворот храповика), тем выше переместится блок и тем толще будет срез. Благодаря тому, что стержень имеет микрометрическую шкалу и специальный зажим, позволяющий менять его положение, можно точно регулировать степень подачи блока.

Так как с каждым срезом блок поднимается все выше, то периодически нужно отсоединять микровинт от разъемной гайки и опускать салазки с механизмом подачи в крайнее нижнее положение.

Уход за микротомом

Хорошее состояние скользящих поверхностей, их чистота и гладкость является основным условием для точной работы микротома, а, следовательно, и получения срезов одинаковой, заданной толщины. Поэтому уходу за ними необходимо уделять главное внимание.

Салазки и направляющие дорожки должны тщательно охраняться от запыления и загрязнения. Для этого, когда микротом не работает, его закрывают специальным футляром или чехлом. Скользящие поверхности должны быть постоянно смазаны тонким слоем нейтрального костного или вазелинового масла, что не только обеспечивает легкость скольжения, но и предупреждает появление ржавчины. Периодически (для удаления загрязненной смазки) скользящие поверхности микротома необходимо протирать тряпочкой, смоченной бензином или толуолом, после чего сразу смазать их.

Помимо чистки и смазки скользящих поверхностей, необходимо проверять правильность затяжки винтов, которыми укреплены направляющие пластины и другие части прибора.

Следует избегать частого перемещения микротома с одного места на другое, так как при этом может быть нарушена точность прибора.

Резку исследуемого объекта на микротоме производят с помощью специальных микротомных ножей.

Следует помнить, что получить хороший тонкий срез можно только при наличии правильно заточенного, очень острого микротомного ножа.