Определение содержания нуклеиновых кислот

Для количественного определения нуклеиновых кислот используют методы, основанные на регистрации их светопоглощения или на специфических реакциях на отдельные компоненты этих соединений. Нуклеиновые кислоты имеют максимум поглощения света при 260 нм, который обусловлен присутствием в них азотистых оснований. Все основания полинуклеотидов обладают тем же максимумом абсорбции, за исключением цитозина, зона наибольшего поглощения которого находится при 270 нм. Поэтому по интенсивности светопоглощения азотистых оснований нуклеотидов можно определить содержание нуклеиновой кислоты в экстрактах из биологического материала или растворах. Однако светопоглощение природной ДНК на 40-50% ниже, чем составляющих ее нуклеотидов. Этот так называемый «гипохромный эффект» связан с двуспиральной структурой природной ДНК. Гипохромный эффект характерен также и для РНК, содержащих спиральные участки или петли.

Учитывая эти особенности нуклеиновых кислот, А.С.Спирин разработал метод измерения светопоглощения гидрализатов ДНК и РНК при двух длинах волн – 270 и 290 нм, поскольку при этих условиях на определение концентрации нуклеиновых кислот практически не влияют различия в их нуклеотидном составе.

Количество нуклеиновых кислот в пробах можно измерить, используя реакции на пентозы с дифениламином и орцином. Однако следует учитывать, что при кислотном гидролизе ДНК разрушается N-гликозидная связь в пуриннуклеотидах, но не в пиримидиннуклеотидах. Поэтому только часть дезоксирибозы становится реакционноспособной, причем величина ее определяется нуклеотидным составом (отношением пуринов к пиримидинам) ДНК.

Практическое значение работ по количественному определению нуклеиновых кислот. Количественное определение нуклеиновых кислот, выделяемых при биохимических исследованиях тканей и клеток, можно проводить прямой спектрофотометрией в ультрафиолетовой области или с помощью специфических реакций на пентозы: дифениламиновой – на дезоксирибозу, а с орциновой – на рибозу. Эти же методы можно использовать и при хроматографическом разделении пуриновых и пиримидиновых нуклеозидов или нуклеотидов. Количественные методы определения нуклеиновых кислот применяются в экспериментальной и клинической биохимии, а также для количественного анализа лекарственных средств нуклеотидной или нуклеозидной природы в контрольно-аналитических лабораториях.

Спектрофотометрический метод количественного

определения нуклеиновых кислот по А.С.Спирину

Реактивы. Хлорная кислота, 1 М раствор.

Оборудование. Штатив с пробирками и капельницами; пипетки вместимостью 2 мл; водяная баня; спектрофотометр.

Материал.

1. Гидролизат дезоксирибонуклеопротеидов ткани селезенки.

2. РНК дрожжевая, свежеприготовленный раствор.

Метод основан на измерении светопоглощения нуклеиновых кислот при 270 и 290 нм, интенсивность которого пропорциональна их количеству в пробах.

Ход определения. В одну пробирку вносят 1,0 мл гидролизата ДНК, в другую – тот же объем раствора РНК и доводят дистиллированной водой до 1,5 мл.

Добавляют в каждую пробу по 1,5 мл раствора хлорной кислоты, закрывают пробирки капельницами и ставят на гидролиз в кипящую водяную баню на 20 мин. Гидролизаты охлаждают. Определяют экстинкцию содержимого каждой пробы на спектрофотометре в кювете с толщиной слоя 1 см при 270 и 290 нм.

Расчет. Содержание ДНК рассчитывают по формуле

(Е₂₇₀ – Е₂₉₀) · 10,1

х₁ = —————————— ,

0,19

а РНК – по формуле

(Е₂₇₀ – Е₂₉₀) · 10,5

х₂ = —————————— ,

0,19

где х₁ и х₂ – концентрации ДНК и РНК, мг/л;

Е₂₇₀ – экстинкция исследуемого гидролизата при 270 нм;

Е₂₉₀ – экстинкция исследуемого гидролизата при 290 нм;

0,19 – удельная экстинкция фосфора нуклеиновых кислот в концентрации 1 мг/л;

10,1 и 10,5 – коэффициенты пересчета содержания фосфора на концентрацию нуклеиновых кислот исходя из теоретического содержания фосфора в ДНК 9,9% и в РНК 9,5%.

Примечание. Предварительно проверяют чистоту образца. Для этого измеряют экстинкцию исследуемых растворов ДНК и РНК при 260, 270 и 290 нм. Отношение Е₂₆₀/Е₂₇₀ не должно быть выше 1,2, а отношение Е₂₇₀/Е₂₉₀ – не меньше 2,0. Если эти условия не соблюдаются, то пробы содержат примеси нуклеиновой природы.

Оформление работы. По результатам измерений отметить чистоту образцов нуклеиновых кислот, рассчитать их концентрацию в исследуемых пробах. В выводе указать возможности данного метода определения содержания нуклеиновых кислот.

Фотоколориметрические методы количественного

определения нуклеиновых кислот

Реактивы. Хлорная кислота, 1 М раствор; дифениламиновый реактив; орциновый реактив.

Оборудование. Штатив с пробирками; пипетки вместимостью 1 и 2 мл; водяная баня; ФЭК.

Материал.

1. Гидролизат ДНК ткани селезенки.

2. ДНК, стандартный свежеприготовленный раствор концентрации 1 г/л.

3. РНК дрожжевая, опытный раствор.

4. РНК, стандартный свежеприготовленный раствор концентрации 1 г/л.

а. Определение содержания ДНК (по Дише). Метод основан на образовании окрашенного комплекса дезоксирибозы с дифениламином, интенсивность которого пропорциональна концентрации этой пентозы в гидролизатах ДНК.

Ход определения. В пробирку наливают 0,5 мл стандартного раствора ДНК и равный объем раствора хлорной кислоты. Ставят пробирку в кипящую водяную баню на 10 мин. Затем охлаждают содержимое.

Во вторую пробирку вносят 1 мл гидролизата ДНК ткани селезенки (опытная проба), затем прибавляют в обе пробирки по 2 мл дифениламинового реактива Дише. Пробы перемешивают стеклянной палочкой и ставят пробирки в кипящую водяную баню на 10 мин для развития окраски. Затем содержимое пробирок охлаждают.

Опытную и стандартные пробы фотометрируют против контрольной пробы на ФЭКе при красном светофильтре (длина волны 595 нм) в кювете с толщиной слоя 0,5 см.

Контрольную пробу готовят перед фотометрией. Она содержит 0,5 мл дистиллированной воды, 0,5 мл раствора хлорной кислоты, 2 мл реактива Дише. Кипятят содержимое пробирки в течение 10 мин на водяной бане. Охлаждают.

Расчет. Содержание ДНК в опытной пробе х (г/л) рассчитывают по формуле

Е_оп

х = ———— ,

Е_ст ,

где Е_оп – экстинкция опытной пробы против контрольной;

Е_ст – экстинкция стандартной пробы против контрольной.

Оформление работы. По экстинкции рассчитать концентрацию опытного образца ДНК, указать в выводе возможность использования дифениламиновой реакции для количественного определения ДНК.

б. Определение содержания РНК. Метод основан на образовании окрашенного комплекса рибозы, входящей в состав РНК, с орцином. Интенсивность окрашивания пропорциональна концентрации РНК в растворе.

Ход определения. В две пробирки добавляют по 2 мл соответственно исследуемого (опытного) и стандартного растворов РНК, приливают по 2 мл орцинового реактива и нагревают на кипящей водяной бане 20 мин. Пробы охлаждают.

Фотометрию опытной и стандартной проб проводят против контрольной на ФЭКе при красном светофильтре (длина волны 670 нм) в кювете с толщиной слоя 0,5 см.

Контрольная проба обрабатывается так же, только вместо раствора РНК используется такое же количество дистиллированной воды.

Расчет. Концентрацию РНК в опытном образце х (г/л) рассчитывают по формуле

Е_оп

х = —————— ,

Е_ст

где Е_оп – экстинкция опытной пробы против контрольной;

Е_ст – экстинкция стандартной пробы против контрольной.

Оформление работы. По экстинкциям рассчитать концентрацию опытного образца РНК, указать в выводе возможность количественного определения РНК по орциновой реакции на пентозы.