Биохимические показатели сахарного диабета

А. Количественное определение содержания глюкозы

в крови глюкозооксидазным методом.

Реактивы. 5%-ный раствор трихлоруксусной кислоты; натрий фосфат двузамещенный, 0,25 моль/л; раствор глюкозооксидазы; фенолфталин 0,5%; рабочий реактив.

Оборудование. Штатив с пробирками; пипетки вместимостью 0,1; 1,0; 2,0 мл; центрифуга с центрифужными весами; ФЭК.

Материал. Кровь, взятая из пальца.

Метод основан на способности глюкозооксидазы при определенном оптимуме рН действия катализировать распад глюкозы с образованием перекиси водорода. Образующаяся перекись водорода в присутствии ионов меди окисляет фенолфталин до фенолфталеина, который в нейтральной области бесцветен, а в щелочной области окрашен в красный цвет.

Ход определения. 0,03 мл крови выливают в 1,5 мл 5% раствора трихлоруксусной кислоты, перемешивают и центрифугируют. К 1 мл надосадочной жидкости добавляют 2 мл 0,25 моль/л фосфата натрия и 2 капли (приблизительно 0,1 мл) раствора глюкозооксидазы. Перемешивают и оставляют стоять при комнатной температуре на 1 час, затем добавляют 2 мл рабочего реактива и через 30 мин фотометрируют в кювете на 10 мм при длине волны 530 нм (зеленый светофильтр).

Одновременно ставят контрольную пробу, в которую берут 1 мл 5% раствора трихлоруксусной кислоты и далее проводят как и опытную пробу.

Расчет. Расчет проводят по калибровочному графику.

Оформление работы. По экстинкции рассчитывают содержание глюкозы в крови, сравнивают ее содержание с нормой и делают вывод о возможных отклонениях.

Практическое значение работы. (См. определение содержания глюкозы в крови орто-толуидиновым методом).

Б. Определение содержания гликозилированного гемоглобина

в эритроцитах крови фотоколориметрическим методом

Реактивы. 40%-ный раствор трихлоруксусной кислоты; 1 М раствор щавелевой кислоты; 0,05 М раствор тиобарбитуровой кислоты; 0,04%-ный раствор гидроксида аммония; 0,9%-ный раствор хлорида натрия.

Оборудование. Центрифуга лабораторная; ФЭК (спектрофотометр); водяная баня; термостат; пробирки с плотно притертыми пробками.

Материал. Кровь забирают натощак из локтевой вены. Добавляют гепарин из расчета 5ед/1мл для предотвращения свертывания. Эритроциты отделяют от плазмы центрифугированием 3000 об/мин в течение 10 минут и трехкратно отмывают физиологическим раствором. Затем к суспензии эритроцитов добавляют дистиллированную воду и 1-2 капли хлороформа для гемолиза.

Метод основан на способности 5-гидроксиметилфурфурола, образующегося из углеводного компонента гликозилированного гемоглобина при его кислотном гидролизе, образовывать с тиобарбитуровой кислотой окрашенное соединение, интенсивность окраски которого пропорциональна содержанию гликозилированного гемоглобина в эритроцитах.

Ход определения.

1. Определение концентрации гемоглобина в гемолизате.

В пробирку внести 8 мл раствора аммиака и добавить 0,05 мл гемолизата (микропипеткой, многократно промывая ее раствором аммиака). Встряхивать 2 минуты, после чего определить экстинкцию на ФЭКе (длина волны 540 нм, зеленый светофильтр) против раствора аммиака. Содержание гемоглобина в гемолизате в г/л определяют по калибровочному графику.

2. Определение процентного содержания гликозилированного гемоглобина.

В пробирку внести объем гемолизата, содержащего 10 мг гемоглобина, довести до 1 мл 0,9% раствором хлорида натрия, добавить 1 мл 1 М щавелевой кислоты, плотно закрыть пробкой и инкубировать в термостате при 100˚С в течение 5 часов.

Пробирку охладить, внести 1 мл 40% раствора трихлоруксусной кислоты, тщательно перемешать и центрифугировать 10 минут при 3000 оборотов в минуту.

В чистую пробирку отобрать 2 мл надосадочной кислоты, перемешать и инкубировать 40 минут на водяной бане при 40˚С, после чего фотометрируют при длине волны 443 нм против дистиллированной воды.

Содержание гликозилированного гемоглобина (в % от общего) определяют по калибровочному графику.

Практическое значение работы. Содержание гликозилированного гемоглобина в норме составляет от 3 до 5,5% от общего. Известно, что уровень гликозилированного гемоглобина может являться показателем уровня гликемии за предшествующие 2-3 месяца. В связи с этим определением уровня гликозилированного гемоглобина в настоящее время применяют для ранней диагностики и оценки компенсации сахарного диабета. Помимо сахарного диабета, повышение уровня гликозилированного гемоглобина может наблюдаться при кистозном фиброзе, заболеваниях, сопровождающихся укорочением жизни эритроцитов, хронической почечной недостаточности.

В. Определение содержания глюкозы в моче глюкозооксидазным методом (с набором «Глюкотест»)

Реактивы.

Набор «Глюкотест»

Материал.

Моча, содержащая сахар.

Метод основан на способности глюкозы в присутствии фермента глюкозооксидазы окисляться с образованием перекиси водорода, которая разрушается под действием пероксидазы. Образующийся кислород окисляет краситель о-толидин и изменение окраски будет свидетельствовать о присутствии глюкозы в моче.

Ход определения.

Одну полоску бумаги «Глюкотест» смачивают нормальной, а другую – патологической мочой. Сравнивают через несколько минут окраску полосок с цветной шкалой, имеющейся в комплекте. Содержание глюкозы в моче определяют по наиболее совпадающему со шкалой цвету полоски.

Оформление работы. Результаты занести в таблицу.

Сделать вывод о присутствии ацетоновых тел и глюкозы в образцах нормальной и патологической мочи и указать на вероятные их причины.

Г. Экспресс-тест на ацетон мочи.

К кетоновым (ацетоновым) телам относятся ацетон, ацетоуксусная и β-гидроксимасляная кислоты.

Ход определения. На каждую из таблеток наносят по 2 капли нормальной и патологической мочи. Через 2 мин сравнивают окраску таблеток с цветной шкалой, приложенной к набору. При отсутствии ацетона окраска не развивается.

Практическое значение работы. В норме пробы на ацетоновые тела и глюкозу в моче отрицательны.

Одновременное выделение ацетоновых тел и глюкозы с мочой наблюдается наиболее часто при сахарном диабете, реже при действии глюкокортикоидов (стероидный диабет), соматотропина и кортикотропина. Глюкозурия без ацетонурии имеет место при употреблении большого количества углеводов с пищей, а ацетонурия без глюкозурии – при голодании.