Микроорганизмы – продуценты ферментов

Наиболее часто в качестве продуцентов амилолитических ферментов в спиртовом производстве используют микроскопические грибы, реже – дрожжеподобные организмы и споровые бактерии.

Микроскопические грибы

Для получения амилаз широко применяют микроскопические грибы рода Aspergillus, видов: niger, oryzae, usamii, awamori, bata-tae, рода Rhizopus, видов: delemar, tonkinensis, niveus, japonicum и др., а также отдельные штаммы Neurospora grassa и Mucor.

Микроскопические грибы очень широко распространены в природе; основное место их обитания – почва. Несмотря на наличие многих родов и видов микроскопических грибов, все они характеризуются нитевидным строением тела и специфическим строением плодоносящих органов. Тело гриба состоит из длинных переплетенных нитей сероватого или белого цвета, называемых гифами. Они распространяются по поверхности питательного субстрата, образуя мицелий, и частично врастают в него. Некоторые гифы, поднимающиеся над поверхностью в виде легкого пушка, имеют более сложное строение и представляют собой органы плодоношения, называемые конидие- или спорангиеносцами. У мукоровых грибов на конце спорангиеносца находится шаровидное вздутие, окруженное оболочкой, внутри которого образуются споры. У аспергиллов конец конидиеносца имеет булавовидное утолщение, от которого отходят удлиненные клетки, называемые стеригмами; от стеригм отшнуровываются более мелкие круглые клетки – конидии.

Отделившиеся конидии или споры, попадая в благоприятные условия, начинают прорастать, затем гифы ветвятся, образуя мицелий; при истощении питательных веществ в среде гриб переходит в стадию споро- или конидиеобразования. Споры и конидии микроскопических грибов содержат пигменты, что и придает зрелым культурам характерную окраску.

Для осахаривания на спиртовых заводах чаще используют аспергиллы: при поверхностном культивировании – Asp. oryzae и Asp. awamori, при глубинном культивировании – Asp. awamori 446 и иногда ВУД-Т2. На спиртовых заводах США применяют высокоактивный штамм Asp. awamori NRRL-3112.

Аспергиллы – типичные аэрофилы, поэтому они могут развиваться только на поверхности твердой или жидкой среды или в жидкой, достаточно аэрируемой среде. Оптимальная температура для большинства аспергиллов 25-30°С, для некоторых – до 35°С. Большинство грибов при поверхностном культивировании могут переносить кратковременное повышение температуры до 40°С и даже 45°С без заметной потери активности ферментов. Оптимальная влажность среды для них около 65%.

Для питания аспергиллов необходимы углеводы, азотистые и минеральные вещества. В качестве источника углевода, кроме моносахаридов, многих олиго- и полисахаридов, могут служить спирты и органические кислоты, однако для накопления амилазы в среде обязательно должны присутствовать крахмал, декстрины или мальтоза. В средах, содержащих другие сахара, в том числе глюкозу, грибы не образуют амилазы. Источником азота могут быть белки и их гидролизаты, аммонийные соли и нитраты.

Среда должна содержать соединения, в состав которых входят сера, фосфор, калий, магний и микроэлементы. Большинство микроскопических грибов усваивают серу из сульфатов, а фосфор – из фосфатов. Аспергиллы не нуждаются в готовых витаминах и факторах роста, так как способны сами синтезировать их из более простых соединений, имеющихся в среде. Препараты ферментов из микроскопических грибов включают, как правило, широкий набор ферментов, поэтому могут полностью заменять зерновой солод.

*1 – Asp. otyzae; 2 – Asp. awamori; 3 – Penicillium; 4 – Mucor; a – мицелий; б – конидие-носцы; в – конидии и споры

На спиртовых заводах стали широко применять высокоактивный по глюкоамилазе штамм Asp. Awamori 466 и ВУД-Т2, выращиваемые на концентрированном кукурузном сусле (18% сухих веществ). Готовая культура имеет активность до 250 ед. ГлА на 1 мл, других ферментов образует мало.

Дрожжеподобные организмы

Амилолитические ферменты синтезируют также некоторые дрожжи и дрожжеподобные грибы родов Saccharomyces, Candida, Endomycopsis и Endomyces.

В спиртовом производстве нашли применение End. bispora и End. Species 20-9, выращиваемые глубинным способом и продуцирующие главным образом активную глюкоамилазу; α-амилазная активность проявляется слабо. Высокоактивный End. bispora имеет разветвленный мицелий, образует бластоспоры; гифы – септированные, зернистые; на твердых агаризованных средах образуют колонии с воздушным серовато-белым мицелием, на жидких питательных средах – гифы и некоторое количество бластоспор.

Дрожжеподобные грибы в спиртовом производстве самостоятельно не применяют, так как они не содержат других ферментов, необходимых для нормального осахаривания сусла из крахмалсодержащего сырья. Обычно их используют в смеси с ферментными препаратами из микроскопических грибов или бактерий.

Бактерии

Активные амилазы способны синтезировать многие бактерии: Вас. subtilis, Вас. diastaticus, Вас. mesentericus, Вас. macerans и Вас. polymycus и др.

Бактерии – продуценты амилолитических ферментов представляют собой палочки длиной 1,2-1,3 мкм и диаметром 0,6-0,8 мкм. Палочки соединяются по две, три, иногда образуют цепочки. Цикл развития бактерий короче, чем микроскопических и дрожжеподобных грибов. Например, культуру Вас. diastaticus выращивают в глубинных условиях при температуре 60°С в течение 10-12 ч.

Бактерию Вас. subtilis-82, применяемую в настоящее время на спиртовых заводах как продуцент α-амилазы в смеси с препаратами глюкоамилазы, выращивают в течение 48-60 ч. при температуре 30-35°С.

Особенность бактерий – их способность образовывать высокоактивную термостойкую α-амилазу, необходимую для разжижения и декстринизации крахмального клейстера на стадии подваривания замесов и осахаривания сусла.