Производственные способы культивирования микроорганизмов-продуцентов ферментов

Существует два способа культивирования микроорганизмов – продуцентов ферментов: поверхностный и глубинный.

Первый способ, применяемый для культивирования микроскопических грибов, характеризуется развитием мицелия на поверхности твердого или жидкого субстрата. На жидком субстрате образуется пленка мицелия, продуцирующего не только амилолитические ферменты, но и органические кислоты, инактивирующие их, поэтому используют твердые субстраты с развитой поверхностью – пшеничные отруби, дробину барды, картофельную мезгу и др.

Максимальная активность ферментов достигается при культивировании грибов на пшеничных отрубях. Дробина барды бедна питательными веществами, и активность ферментов в культурах грибов, выращенных на ней, в 4-5 раз ниже, чем на отрубях. Зрелая культура грибов вследствие обволакивания частиц отрубей мицелием имеет вид плотной войлокообразной массы.

При поверхностном культивировании пшеничные отруби должны быть увлажнены и простерилизованы. В стерильных условиях готовят посевную культуру, но выращивают грибы в нестерильных условиях в кюветах, устанавливаемых в негерметичных растильных камерах. Теплоту, выделяющуюся в процессе роста грибов, удаляют продуванием через растильную камеру стерильного кондиционированного воздуха.

Поверхностный способ выращивания микроскопических грибов имеет ряд преимуществ. Так как во время роста гриба отруби не перемешиваются, посторонние микроорганизмы не распространяются по всей их массе и вызывают лишь незначительное местное инфицирование, которое, как правило, не влияет на активность ферментов. Это, однако, не исключает необходимости тщательной стерилизации воздуха, среды и оборудования. Культуру на отрубях высушивают до содержания влаги 10-11%. В таком виде она может храниться продолжительное время без значительной потери активности. Это позволяет организовать централизованное снабжение спиртовых заводов сухой культурой микроскопических грибов, что является одним из преимуществ поверхностного способа выращивания.

Недостаток поверхностного способа – необходимость устанавливать множество кювет, работу с которыми трудно механизировать. Себестоимость культуры гриба-продуцента высока, причем в основном из-за затраты большого количества ручного труда. Механизация процесса выращивания возможна путем создания непрерывнодействующих установок или бескюветных аппаратов с вертикальным толстым слоем питательной среды и интенсивным продуванием воздуха через этот слой.

Глубинную культуру микроорганизмов выращивают на жидкой питательной среде при энергичной аэрации в герметически закрытых аппаратах и в стерильных условиях. Процесс полностью механизирован. Стерильность глубинной культуры микроорганизма-продуцента ферментов положительно отражается на результатах сбраживания сусла дрожжами.

Поверхностное культивирование микроскопических грибов.

Питательные среды.При поверхностном культивировании твердой средой обычно служат пшеничные отруби, содержащие в достаточных количествах все вещества, необходимые для питания грибов. Лучшие результаты достигаются при содержании не менее 16% крахмала в отрубях или в другой питательной среде.

Получение посевного материала.Для засева производственной питательной среды может быть использован посевной материал трех видов: споры, мицелий и спороносящая культура, выращенная на твердой питательной среде.

Споровый материал готовят поверхностным культивированием гриба на твердой или жидкой питательной среде в специальных аппаратах с кюветами. В первом случае гриб выращивают в пробирке на косом агаре до обильного образования спор, затем спорами засевают колбы со стерильными пшеничными отрубями, наконец, спороносяшую культуру передают в специальный аппарат. По окончании спорообразования в этом аппарате отбирают споры посредством специального вибросепаратора при тщательной аспирации. Споры фасуют в полиэтиленовые мешочки, стеклянные или дюралюминиевые банки, в которых они могут сохраняться при температуре от 8 до 24°С около 1,5 лет.

Во втором случае из спор, собранных в пробирке с косым агаром, готовят водную суспензию и ею засевают жидкую питательную среду, которую направляют в растильный аппарат. Из-под выросшей спороносящей пленки удаляют жидкую среду, пленку подсушивают, снимают с кювет, измельчают и упаковывают. Готовый споровый материал не содержит примеси среды и обладает высокой всхожестью (90-95%), которая сохраняется свыше 3 лет.

Споры (конидии), полученные любым методом, обладают водоотталкивающей способностью и почти не смачиваются водой. Это свойство приводит к неравномерности засева среды и, следовательно, к неодинаковой скорости роста культуры. Смачиваемость спор можно улучшить, если добавить в их водную суспензию 25-50 мг поверхностно-активного вещества, например алкилбензолсульфата на 1 г спорового материала. При этом всхожесть спор остается без изменения.

Для сокращения длительности культивирования микроскопических грибов в производственных условиях можно применять предварительное проращивание спор в течение 7 ч. в жидкой питательной среде до появления ростовых трубочек. При этом продолжительность лаг-фазы сокращается на 8-9 ч. и увеличивается оборачиваемость растильных камер.

При использовании спорового материала упрощается технологический процесс, появляется возможность более полно механизировать его, а также сократить площадь цеха чистой культуры. Централизованное производство спорового материала для группы предприятий, работающих с данным штаммом гриба, выгодно создать в одном специализированном цехе чистой культуры. Положительный опыт подобной организации имеется в производстве лимонной кислоты биотехнологическим способом.

Исследователями было предложено засевать производственную питательную среду мицелием, полученным глубинным культивированием гриба или бактерий в колбах на качалке. При высокой производительности предприятия целесообразно выращивать посевной мицелий в небольших ферментерах, как это было предложено А.П. Левчиком и осуществлялось на Мичуринском экспериментальном ферментно-спиртовом заводе.

На спиртовых заводах получило распространение приготовление посевного материала в виде поверхностной культуры гриба на пшеничных отрубях, которое складывается из следующих двух операций:

– выращивание спороносной культуры гриба в пробирках на сусло-агаре;

– засев спорами пшеничных отрубей в колбах и выращивание культуры гриба.

Культуру получают из лаборатории чистых культур. Исходная – музейная чистая культура хранится в холодильнике при температуре от 2 до 4°С. Один раз в месяц пересевают споры музейной культуры из пробирки в пробирку с сусло-агаром с соблюдением правил проведения микробиологических работ. При этом первая засеянная пробирка является музейной, а остальные две-три пробирки используют для дальнейшего размножения. Засеянные пробирки помещают в термостат при температуре 30°С и выдерживают в нем в течение 4-6 сут.

При нормальном росте поверхность сусло-агара равномерно покрывается спороносящим мицелием. Культура гриба с плохим спороношением, медленно растущим мицелием, пушком вторичного роста в производство не допускается. Пробирки с выросшеи культурой вынимают из термостата и хранят в холодильнике. Перед посевом в колбы проверяют чистоту культуры высевом в чашки Петри и микроскопированием.

Чистая культура на сусло-агаре служит исходным материалом для размножения грибов на пшеничных отрубях в колбах. Отруби смешивают с водопроводной водой в соотношении 1:0,7 и переносят в несколько колб по 10-20 г. в каждую. Колбы закрывают ватными пробками и стерилизуют в автоклаве при избыточном давлении 0,15 МПа в течение 1 ч. После охлаждения до комнатной температуры в колбы вносят суспензию спор гриба, содержащую 150-200 тыс. спор в 1 мл. Для этого в пробирку с культурой гриба на сусло-агаре прибавляют 10 мл стерильной водопроводной воды и при помощи стерильной пипетки над огнем соскабливают конидии гриба. Полученную суспензию используют для посева (2-2,5% массы засеваемой среды или 0,4-0,5 мл на 10 г отрубей).

Выращивание ведут в термостате при температуре 30°С в течение 4-5 сут. Одну из колб предназначают для дальнейшего размножения чистой культуры, остальные колбы хранят в холодильнике до последующего цикла. В колбу, используемую для размножения, вливают 50-60 мл стерильной водопроводной воды и над пламенем стерильной пипеткой тщательно перемешивают.

Расход чистой культуры при пересеве из колбы в колбу или банку составляет 5-10% массы засеваемой среды.

Размножение посевного материала. Пшеничные отруби подготавливают так же, как и при получении чистой культуры. Отруби, стерилизованные в бюксах под избыточным давлением 0,15 МПа в течение 1,5 ч., переносят на специальный стол, предварительно вымытый и продезинфицированный. Охлаждение отрубей до температуры 40-42°С проводят перемешиванием с соблюдением правил микробиологической чистоты. Затем их засевают спорами из колбы с чистой культурой (расход культуры 0,5-1% массы отрубей). Суспензию спор готовят из расчета 1 часть культуры на 5 частей воды. Засеянные отруби распределяют по кюветам, предварительно простерилизованным при 120°С в течение 2 ч., слоем толщиной 2-2,5 см. Кюветы сверху закрывают крышкой, под которую подкладывают стерильную бумагу на отверстие по центру крышки накладывают стерилизованную ватную подушку, после чего кюветы помещают в термостат на 18-24 ч. при температуре 30-32°С. В дальнейшем кюветы устанавливают на стеллажи, расположенные в самой растильной камере, и ведут выращивание при 24-28°С в течение 3-4 сут. Выросшую культуру затем помещают в комнату подсушки и в воздушно-сухом состоянии передают на хранение в кладовую, температура в которой не должна превышать +8ºС, но не ниже.

Посевной материал, приготовленный описанным способом, представляет собой спороносную культуру гриба, содержащую не менее 0,7 млрд. спор в 1 г., из которых 86-90% способны к прорастанию. Посевной материал не должен содержать посторонней микрофлоры, подвергаться замораживанию, оттаиванию и увлажнению.

Производственное культивирование. Способ получения культуры микроскопических грибов в растильных камерах на кюветах связан с большими затратами ручного труда, однако пока применяется на заводах.

Пшеничные отруби ковшовым элеватором подают на автоматические весы 2, отсюда они поступают в загрузочный бункер 3, а из него в стерилизатор 5. В этом аппарате отруби увлажняются водой, подаваемой через форсунки из бака 4 для стерильной воды. На 1 кг отрубей добавляют 0,2 л воды и 7-8 мл соляной кислоты относительной плотностью 1,19 или 2,7-3,0 мл серной кислоты плотностью 1,84. Отруби стерилизуют острым паром при температуре 103-105°С (давление 0,07 МПа) в течение 1-1,5 ч., периодически включая мешалку. По окончании стерилизации влажность отрубей доводят до 58-60%, охлаждают их до 40-42ºС и затем вносят культуру гриба, полученную в отделении чистых культур.

Расход посевного подсушенного материала составляет 0,5-0,6% массы отрубей. Посевной материал вводят в виде водной суспензии, приготовляемой из культуры гриба в 5-, 10-кратном количестве кипяченой воды.

Технологическая схема получения культуры микроскопических грибов в камерах на кюветах.

Засеянную среду тщательно перемешивают в течение 15-20 мин., выгружают на раскладочный стол 6 и распределяют по кюветам. Наполненные кюветы ставят в этажерки 7, перевозят их на тележках в растильную камеру 8, в которой поддерживают температуру 30-32ºС в течение 12-16 ч. (до начала интенсивного роста). В дальнейшем из кондиционера 9 в камеру подают вентилятором кондиционированный воздух температурой 26-28ºС и относительной влажностью 96-100%. К концу выращивания культуры температуру снижают до 24-26°С. Общая продолжительность выращивания 36-42 ч. В тех случаях, когда использование готовой культуры для осахаривания разваренной массы задерживается более чем на 2 ч., ее высушивают до влажности 18-20%.

При необходимости транспортировки на дальние расстояния культуру гриба дробят на шнеке-дробилке 10 и дезинтеграторе 11 до получения частиц размером не более 10 мм и высушивают в сушилке 18 теплым воздухом до содержания влаги не более 10-12%. Воздух нагревают в калорифере 20 и подают в сушилку вентилятором 19. Отработавший воздух удаляют вентилятором 17 и выбрасывают в атмосферу через циклон 14. Высушенную культуру шнеком 16 подают на весы 15 для фасования. Сюда же подаются уловленные в циклоне частички культуры, унесенные воздухом. Освободившиеся кюветы проходят через мойку 12, обеспложиваются в стерилизаторе 13 и возвращаются под загрузку.

Готовую культуру гриба упаковывают в бумажные крафт-мешки. Каждый мешок снабжают этикеткой или биркой с указанием завода-изготовителя, наименования продукта, даты выпуска, номера партии, активности ферментов и массы. Хранят культуру в сухом помещении на деревянных стеллажах.

Предложены технологические схемы производства поверхностных культур плесневых грибов с использованием механизированных растильных установок: с вертикальными каналами (установка была смонтирована на Мичуринском экспериментальном заводе и может быть использована на предприятиях средней мощности – до 2 т культуры гриба в сутки); непрерывнодействующей конвейерно-пластинчатой, предназначенной для специализированных ферментных предприятий мощностью более 2 т культуры в сутки.

Глубинное культивирование микроорганизмов.

При глубинном культивировании микроорганизмы развиваются во всем объеме жидкой питательной среды. Так как подавляющее большинство продуцентов ферментов – строгие аэробы, среду интенсивно аэрируют. В микроорганизмах протекают два связанных процесса – синтез биомассы и синтез ферментов.

Питательные среды. Для глубинного культивирования используют жидкие среды, содержащие твердые компоненты. При работе с комплексными средами, основанными на естественном сырье с добавлением отрубей, ростков, кукурузного жмыха, глютена, свекловичного жома, спиртовой барды, следят за тем, чтобы не было крупных комочков, так как они затрудняют стерилизацию и могут привести к закупорке коммуникаций. Поэтому перед смешением твердых компонентов необходимо проводить их просеивание или грубую фильтрацию (например, зерно-картофельной барды).

Жидкую часть питательной среды (воду или фильтрат барды) обогащают питательными солями, гидролизатами белков, аминокислотами, источниками витаминов, различными углеводами. Содержание сухих веществ в жидких средах может колебаться от 1,5 до 20% в зависимости от продуцента и принятого режима культивирования.

В научно-исследовательских организациях постоянно проводится работа по улучшению эффективности производства ферментных препаратов, в основном по повышению активности зрелой культуры. Это достигается не только селекцией штаммов микроорганизмов, но и совершенствованием условий культивирования, в том числе и изменением состава питательной среды, поэтому приведенные среды могут подвергаться значительным изменениям при корректировании аэрации и других условий культивирования.

Получение и размножение посевного материала. Для засева производственной питательной среды при глубинном культивировании посевной материал готовят глубинным или поверхностным способом. Вид посевного материала зависит от продуцента:

– для грибов это вегетативная мицелиальная масса или спороносящая поверхностная;

– для бактерий – молодая растущая культура на начальной стадии спорообразования.

Посевной материал получают постадийным увеличением массы культуры продуцента. При небольшой производительности цеха это сводится к одной или двум операциям, а для заводов большой производительности представляет собой многоступенчатый процесс.

В связи с вводом штаммов микроскопического гриба Asp. awamori 466 или ВУД Т~2 усовершенствована и значительно упрощена схема приготовления спорового взамен вегетативного посевного материала. В простейшем виде она выглядит следующим образом. Пробирку с исходной культурой на агаризованной питательной среде пересевают водной суспензией в колбы со стерильными отрубями, которые выдерживают в термостате до полного созревания культуры. Из колб посевной материал в виде водной суспензии спор пересевается непосредственно в производственный ферментер, минуя инокулятор. В зависимости от объема ферментера количество посевных колб увеличивают в 2-4 раза. Спорового посевного материала вполне хватает для того, чтобы вырастить достаточно активную культуру при обычной продолжительности процесса. При этом получаются большой выигрыш в трудоемкости операций и более надежная защита от инфекции, так как в 2 раза сокращаются число операций и продолжительность выращивания посевного материала.

Культивирование на всех стадиях должно проводиться при оптимальной температуре, аэрации и строго определенное время. Если возникают непредвиденные задержки в использовании, то посевной материал охлаждают до 8-10°С и хранят не дольше 4 ч., иначе качество его может резко ухудшиться.

Посевной материал как на отдельных стадиях, так и готовый подвергают тщательному микробиологическому контролю. Он не должен быть инфицирован посторонней микрофлорой, в нем должно содержаться определенное количество спор или клеток на единицу массы, генетически заложенные в нем свойства продуцировать ферменты должны стойко сохраняться.

Производственное культивирование. Известны следующие способы глубинного культивирования: периодический, непрерывно-циклический и непрерывно-проточный.

Периодический способ характеризуется несменяемостью питательной среды в ферментере, состав которой в процессе развития постепенно изменяется. Процесс протекает постадийно: в ферментер набирают питательную среду и задают посевной материал; после размножения микроорганизмов и накопления продуктов их обмена зрелую культуру выгружают, а все оборудование, коммуникации и запорные устройства промывают, а затем стерилизуют паром.

При непрерывно-циклическом способе микроорганизмы, расположенные на неподвижной насадке в ферментере, омываются средой, протекающей в замкнутом контуре, до полного потребления ими питательных веществ. После этого зрелую культуру выгружают, начиная с последнего, аппараты промывают, стерилизуют и цикл повторяют с последнего головного ферментера. Богатая питательными веществами среда в ходе такой циклической ферментации постепенно истощается; по времени пребывания среды в зоне реакции этот процесс более продолжителен, чем периодический.

Непрерывно-проточный способ культивирования микроорганизмов более совершенен. Суть его заключается в том, что микробная популяция развивается в проточной питательной среде. Способ имеет две разновидности: гомогенно-непрерывный и градиентно-непрерывный. В первом случае выращивание ведут в одном ферментере; при тщательном перемешивании среды и аэрации обеспечивается одинаковое состояние культуры во всем объеме жидкости. В ферментер при этом непрерывно поступает свежая среда, а из него также непрерывно вытекает избыток зрелой культуральной жидкости.

Градиентно-непрерывное культивирование осуществляют в батарее ферментеров, соединенных переточными трубами. Засеянная среда с большим содержанием углеводов и других ингредиентов непрерывно перетекает из одного ферментера в другой и также непрерывно вытекает в виде готовой культуры.

Непрерывным культивированием в проточных средах можно выращивать микроорганизмы в условиях, оптимальных для их стадии развития. При этом такие важные факторы, как концентрация питательных веществ, количество продуктов обмена, рН, содержание растворенного кислорода, резко изменяющиеся при периодическом способе культивирования, поддерживаются постоянными на заданном уровне или изменяются по разработанной программе.

Способы непрерывного культивирования в производстве ферментных препаратов для спиртового производства еще находятся в стадии производственных испытаний. Поэтому, к сожалению, в настоящее время на заводах до сих пор применяют периодическое культивирование микроорганизмов.

 

 

Технологическая схема глубинного культивирования Asp. awamori для производства Глюкаваморина Гх-466.

1 – фильтр грубой очистки; 2 – компрессор; 3 – алагоотделитель; 4, 21 – теплообменники; 5 – маслоотделитель; 6, 22 и 25 – фильтры; 7 – шнек для подачи муки; 8 – смеситель; 9, 16, 19, 27, 29 – насосы; 10 – варочный аппарат; 11 – осахариватель; 12 – солододробилка; 13 – бак для солодового молока; 4 – дозатор; 15 – смеситель; 17, 18 – контактные головки; 20 – стерилизатор; 23 – инокулятор; 24 – ферментер; 26 – бачок для пеногасителя; 28 – скруббер.

Посевной материал готовят в производственном инокуляторе 23, представляющем собой цилиндрический сосуд со сферическим днищем и крышкой.

Аппарат имеет следующие узлы и арматуру: устройство для аэрации и перемешивания (форсунки или барботеры, двухъярусная мешалка); патрубок для подвода пара; посевной люк; пробоотборник; гильзы для термометра; патрубки для подачи питательной среды и спуска промывных вод, для манометра, подвода и отвода воздуха; люк для мойки и осмотра аппарата; линию спуска готового посевного материала; индивидуальный воздушный фильтр. Корпус аппарата имеет рубашку для охлаждения.

При заполнении аппарата питательной средой открывают подачу пара на аэрирующее устройство и включают насос для питательной среды.

В качестве питательной среды используют осахаренное сусло из кукурузной муки, приготовленное в смесителе 15, с содержанием сухих веществ 6% по сахаромеру. Для этого в смеситель 15 набирают воду и при постоянной работе мешалки из осахаривателя 11 насосом 19 перекачивают сусло. Соотношение сусла и воды должно быть 1:2. После тщательного перемешивания питательную среду нагревают в контактной головке 7 до 85°С путем многократного перекачивания насосом 16.

Подогретую среду передают в подготовленный посевной аппарат. С целью предотвращения пенообразования перед подогревом в среду добавляют подсолнечное масло из расчета 0,1-0,15 % объема.

В посевном аппарате 23 среда сначала подогревается до 100°С острым паром, подаваемым через форсунку, линию передавливания и нижний спускной штуцер при открытой выхлопной воздушной линии. Затем вентиль на выхлопной линии закрывают, и температура среды поднимается до 121-123°С (давление 0,1-0,15 МПа). При такой температуре среда выдерживается в течение 60 мин. По окончании стерилизации давление в аппарате медленно снижается до 0,03-0,05 МПа. Затем в аппарат постепенно подается стерильный воздух для поддержания избыточного давления в нем 0,02-0,03 МПа, а в рубашку аппарата поступает холодная вода.

После охлаждения массы до 27°С засевают среду культурой, полученной на второй стадии, в количестве 0,5-1,0% через посевной люк с соблюдением условий стерильности при минимальном движении окружающего воздуха.

Режим выращивания посевного материала: давление 0,02-0,03 МПа, температура 27-28ºС, расход воздуха 16 м³/(м³ч), частота вращения мешалки 5,8 с~К Продолжительность выращивания посевного материала 24 ч.

Через 12 ч. после начала выращивания и перед посевом в ферментер с соблюдением условий стерильности из аппарата отбирают пробы для определения рН, посторонней микрофлоры, концентрации сухих веществ.

Глубинную культуру выращивают в ферментере из нержавеющей стали в стерильных условиях при постоянном перемешивании и аэрировании среды.

Процесс выращивания глубинной культуры состоит из следующих операций: подготовка ферментера к приему питательной среды, приготовление питательной среды, стерилизация питательной среды, охлаждение и засев питательной среды посевной культурой в ферментере, ферментация.

Ферментер 24 снабжен рубашкой для обогрева и охлаждения, аэрирующим устройством, патрубками для подвода пара, посевной и спускной линиями, гильзой для термометра, штуцером для манометра, пробоотборником, пеногасительным бачком и индивидуальным воздушным фильтром.

Подготовка ферментера к приему питательной среды состоит в мойке, осмотре, проверке герметичности и стерилизации при температуре 120-125°С в течение 60 мин.

После снятия давления и охлаждения до температуры 27-28°С в ферментер загружают питательную среду.

Для приготовления питательной среды используют кукурузное сусло с концентрацией сухих веществ 18-20%, которое получают по следующей схеме: кукурузную муку через порционные автоматические весы шнеком 7 загружают в смеситель 8, в который одновременно и при постоянной работе мешалки поступает вода температурой не более 45°С. Соотношение муки и воды 1:(2,5-3,0).

Полученную массу насосом 9 перекачивают в варочный аппарат 10, работающий под давлением. Масса в аппарате нагревается острым паром, который подводят снизу. Разваривание проводится при температуре 143-151ºС, давлении 0,3-0,4 МПа в течение 15-20 мин.

Разваренная масса поступает в осахариватель 11, оборудованный змеевиком для охлаждения. Перед подачей массы в осахариватель добавляют воду в количестве 5% объема разваренной массы.

Разваренную массу охлаждают до 63°С и осахаривают солодовым молоком, которое получают смешиванием в баках 13 измельченного на солододробилке 12 солода и воды. Соотношение солода и воды 1:(6-8). Продолжительность осахаривания при температуре 58-60°С составляет 30 мин.

Питательная среда концентрацией сухих веществ 18-20%, рН 5,3-5,6 и температурой 75-80ºС из осахаривателя 11 плунжерным насосом 19 подается через контактную головку 18, где нагревается до 120-125°С, в трубчатый стерилизатор 20, где выдерживается 30-40 мин, затем охлаждается в теплообменнике 21 до 35°С и поступает в ферментер, в котором в процессе заполнения поддерживают давление 0,1-0,12 МПа.

После заполнения ферментера всю систему освобождают от среды, промывают водой для удаления взвешенных частиц питательной среды и стерилизуют острым паром в течение 30-40 мин при 0,2-0,25 МПа. При освобождении и прокачке системы питательная среда и вода спускаются в смеситель 5. Расход воды при этом должен в 2-3 раза превышать объем системы.

Среда засевается в ферментер по линии передавливания, предварительно простерилизованной острым паром в течение 1 ч.

Перед засевом из ферментера отбирают пробы среды через пробоотборник для микробиологического высева (на мясопептонный бульон или мясопептонный агар) и биохимического анализа.

Для засева закрывают вентиль на выходной воздушной линии у посевного аппарата 23 и поднимают давление до 0,06-0,08 МПа, а в ферментере оставляют давление 0,02-0,03 МПа. После этого открывают вентиль на линии передавливания посевного аппарата в ферментер, и посевная культура под действием разности давлений поступает в ферментер. Закрывают вентиль на линии передавливания, включают мешалку и начинают процесс выращивания культуры в ферментере. Количество посевного материала составляет 3% объема питательной среды в аппарате.

Режим выращивания: температура 34-35°С, давление 0,02-0,03 МПа. Расход стерильного воздуха 30-60 м³/(м³-ч), частота вращения мешалки 2,5-2,8. Продолжительность выращивания 120-160 ч.

Для обеспечения стерильных условий при культивировании необходимо строго следить за стерильностью подаваемого на аэрацию воздуха.

От механических примесей и микроорганизмов воздух очищается с помощью системы тройной очистки, для этого перед компрессором устанавливают висциновый фильтр грубой очистки 1.

Для подачи воздуха применяют компрессоры 2. Влага и масло отделяются от воздуха после компрессора во влагоотделителе 3 и маслоотделителе 5.

В теплообменнике 4 воздух подогревается до 60-80°С в зависимости от температуры наружного воздуха в помещении. Очистка воздуха после теплообменника 4 и маслоотделителя 5 от посторонней микрофлоры происходит в общем (головном) фильтре 6, заполненном базальтовым волокном. После головного фильтра воздух подается в коллектор, а затем дополнительно очищается на индивидуальных фильтрах 22 и 25, заполненных базальтовым волокном и установленных соответственно перед каждым маточником и ферментером.

Индивидуальные фильтры стерилизуются вместе с посевным аппаратом и ферментером острым паром в течение 2 ч. при давлении 0,18-0,20 МПа. Влага из фильтров удаляется продуванием через них горячего воздуха.

Необходимо систематически контролировать стерильность поступающего на аэрацию воздуха. Для проверки стерильности воздуха колбу вместимостью 0,5-1,0 л со 100-150 мл стерильного мясо-пептонного бульона стерильно присоединяют к специальному пробному кранику воздуховода и продувают воздух через мясопептонный бульон в течение 10-12 ч., при этом бульон не должен сильно пениться. Затем плотно зажимают шланги выхода и входа воздуха, закрывают пробный краник воздуховода, отсоединяют колбу и выдерживают ее в термостате при 37±0,5ºС в течение 48 ч. При наличии даже небольшого помутнения отмечают нестерильность воздуха.

Для микробиологического и биохимического контроля развития культуры с соблюдением всех условий стерильности отбирают пробы из ферментера: вначале через 72 ч. после посева, а затем через каждые сутки роста. В пробах определяют глюкоамилазную активность, рН, концентрацию сухих веществ, стерильность, состояние культуры и отсутствие посторонней микрофлоры при микроскопировании.

Готовый ферментный препарат Глюкаваморин Гх должен удовлетворять следующим требованиям: активность глюкоамилазы не менее 200 ед/мл; концентрация сухих веществ в фильтрате 8-10%; рН 3,0-3,5; посторонная микрофлора отсутствует.

В случае развития инфекции ферментер стерилизуют в течение 2 ч. при 126-133°С и давлении 0,18-0,2 МПа, а препарат подают на микроультрафильтрационную систему. Инфицирование ферментера не допускается.

Готовый препарат насосом подается на производство спирта в предварительно стерилизованные сборники, снабженные системой охлаждения до 8-12°С.

Кроме препарата Глюкаваморин Гх, в спиртовом производстве могут применять и препараты других микроорганизмов-продуцентов амилолитических ферментов, например Амилодиастатин Гх, Глюкобататин Гх, Глюкоэндомикопсин Гх, Амилоризин Гх и др.

Принципиальная технологическая схема производства этих препаратов практически не отличается от схемы, по которой производятся препараты Глюкаваморин Гх и Амилосубтилин Гх. Отличия, обусловленные биологическими особенностями микроорганизмов, состоят в различных способах введения посевного материала и технологических режимах выращивания микроорганизмов в лабораторных и производственных условиях, неодинаковом составе питательных сред. Все эти условия определяются соответствующими регламентами на производство каждой из перечисленных культур.

Дальнейшее совершенствование способа культивирования микроскопических грибов состоит в полном освоении непрерывного процесса их выращивания с целью резкого повышения производительности.