Монооксид азота и его функциональная роль в организме

Одним из наиболее ярких открытий последних лет, имеющее фундаментальное значение, позволившее по-новому подойти к пониманию молекулярного механизма ряда физиологических процессов в клетке, является установление важной роли монооксида азота (NO) в регуляции различных физиологических и биохимических процессов. Началом "NO-истории" можно считать отмеченный в 1980 г. факт, согласно которому действие некоторых вазодилататоров не реализуется в отсутствие или в условиях повреждения эндотелия сосудов (так называемые "эндотелий-зависимые вазодилататоры"). Был выделен фактор, осуществляющий отмеченный эффект эндотелия ─ эндотелиальный фактор релаксации сосудов (EDRF), природа которого оставалась неясной до 1987 г, когда было установлено, EDRF представляет собой окись азота (NO). Как вскоре оказалось, NO (EDRF) синтезируется не только в эндотелиальных, но во многих других тканях, органах, в том числе и в нервной системе. В соответствии с приведенной выше классификацией NO является агентом паракринной или аутакоидной регуляции на периферии и медиатором в мозге.

Идентификация монооксида азота увенчалась присуждением Нобелевской премии 1998 г. по физиологии или медицине Фэрчготту, Игнарро и Мураду.

Монооксид азота по своей химической природе относится к двухатомным нейтральным молекулам. Малые размеры и отсутствие заряда обеспечивают этой молекуле высокую проницаемость через мембраны клеток и субклеточных структур. Наличие одного электрона с неспаренным спином придает молекуле NO достаточно высокую реакционную способность. Взаимодействуя с другими свободными радикалами, NO способна образовывать ковалентные связи. Благодаря этой способности NO может как активировать цепные свободнорадикальные реакции, так и ингибировать их. Кроме того, NO может взаимодействовать с белками и низкомолекулярными соединениями, содержащими в активном центре ионы переменных металлов, а также вступает в окислительно-восстановительные превращения, образуя многочисленные азотсодержащие соединения.

NO синтезируется из L-аргинина при участии фермента NO-синтазы (NOS) путем присоединения молекулярного кислорода к концевому атому азота в гуанидиновой группе L-аргинина. Эта простейшая сигнальная молекула продуцируется одним из наиболее сложных ферментов, для проявления активности которого требуется 5 кофакторов: NADPH, FAD, FMN, тетрагидробиоптерин и Са²⁺/кальмодулин. Кроме того, NOS содержит гем. Выделены три изоформы NO-синтаз: эндотелиальная (eNOS), нейронная (nNOS) и индуцибельная (iNOS, содержится в марофагах). Активность различных изоформ NO-синтаз колеблется в широком пределе: нейрональная NO-синтаза имеет максимальное значение около 300, макрофагальная – до 1000, эндотелиальная - около 15 нмоль/мг/мин. Нейронная NO-синтаза имеет молекулярный вес около 160000, тогда как макрофагальная и эндотелиальная около 130000. Все изоформы NOS обнаруживают высокую степень гомологии с цитохром Р-450 редуктазой. Эта гомология отражает родственную природу систем окислительного биосинтеза NO и микросомального окисления. Удивительно, но этим сходство не ограничивается. Недавно цитохром Р-450 редуктаза была обнаружена в мозге, где она является донором электронов для гем-оксигеназы. В результате гем-оксигеназной реакции кроме продуктов распада гема образуется угарный газ СО, который, как оказалось, тоже играет сигнальную роль в нервной системе.

eNOS обнаружена в эндотелии всех сосудов (включая церебральные), в сердце (эндокарде и миокарде) и в тромбоцитах. Хотя эндотелиальную NO-синтазу относят к конститутивным изоформам, уровень ее генной экспресии может изменяться под влиянием некоторых факторов и при патологических состояниях.

Вторая конститутивная форма NO-синтазы ─ нейронная, экспрессирована в нейронах. Клетки, содержащие nNOS, характеризуются сильноразветвленной системой отростков и составляют около 2% общего количества нейронов. Наиболее высока активность nNOS в обонятельной луковице и мозжечке, несколько ниже ее уровень в среднем мозге, стриатуме, коре, гиппокампе и продолговатом мозге. NO играет важную роль в регуляции мозгового кровообращения.

Большое число NO-ергических нейронов находится в вегетативной нервной системе, где они управляют важнейшими вегетативными функциями. Нервные клетки содержащие NO-синтазу найдены по всей длине пищеварительного тракта в т.н. энтеральной нервной системе, где они расслабляют гладкие мышцы пищевода, желудка, кишечника и практически всех сфинктеров (кардиального, пилорического, анального и др.). Монооксид азота выделяется в окончаниях парасимпатических нервов, иннервирующих половые органы, за счет чего происходит переполнение кровью пещеристых тел и эрекция. Нейронная NOS найдена в скелетной мускулатуре, где NO наряду с другими факторами (рН, аденозин, К⁺) участвует в обеспечении рабочей гиперемии (в покое мышцы отличаются незначительным кровоснабжением).

В отличие от эндотелиальной и нейронной NO-синтаз, которые экспрессированы постоянно (конститутивно), индуцибельная изоформа NO-синтазы не представлена в клетках в обычных состояниях. Она играет ведущую патофизиологическую роль в реализации цитотоксических функций активированных макрофагов. Основная функция NO, вырабатываемого макрофагами, ─ цитотоксическое действие на клетки-мишени (опухолевые, а также бактерии, вирусы и др.). Макрофагальная NOS найдена и мозге, где ее экспрессируют особые клетки глии – т.н. микроглия.

Монооксид азота активирует растворимую форму (т.е. не связанную с мембраной) фермента гуанилатциклазы. Это основная мишень действия NO в нервных клетках. Гуанилатциклаза катализирует синтез цГМФ из ГТФ. цГМФ опосредует (через изменение уровня кальция, активности цГМФ-зависимых протеинкиназ, фосфодиэстераз и др.) регуляторные эффекты NO. Кроме этого, монооксид азота является реакционноспособной молекулой и может сам по себе, без участия каких либо ферментов модифицировать различные белки (например, нитрозилировать по SH группам цистеина), в том числе, белки ионных каналов. Нитрозилированные белки натриевых каналов инактивируются и теряют способность участвовать в проведении нервных импульсов. Недавно установлено, что нитрозилированию подвергается аденилатциклаза в нервных клетках, что приводит к потере способности этого фермента активироваться сигнальными молекулами. Нитрозилирование аденилатциклазы и ионных каналов обратимо в восстанавливающих условиях, что свидетельствует о подлинной регуляторной роли этого механизма в управлении активностью ферментов и ионных каналов.

В нейронах гиппокампа NO синтезируется в постсинаптических нейронах в ответ на активацию NMDA-рецепторов глутаматом. Вход кальция в клетку при этом активирует nNOS, которая синтезирует NO из L-аргинина. Образующийся в ответ на этот импульс NO в свою очередь диффундирует из постсинаптического нейрона в пресинаптическое окончание (ретроградно), где оказывает облегчающее влияние на выделение нейромедиатора глутамата. Этот механизм лежит в основе одной из наиболее важных физиологических функций NO в головном мозгу: NO участвует в процессах долговременной синаптической потенциации - феномена, связанного с образованием памяти.

Будучи липофильной молекулой, NO свободно переходит через поверхностные мембраны эндотелиальных и гладкомышечных клеток сосудов, стимулируя образование в них цГМФ, который, при посредстве протеинкиназы G и цАМФ-специфичной цГМФ-зависимой фосфодиэстеразы (ФДЭ II) уменьшает концентрацию ионизированного кальция в цитоплазме. Первый фермент активирует кальциевую помпу в саркоплазматическом ретикулуме, второй снижает уровень цАМФ, что угнетает проводимость кальциевых каналов плазмалеммы. Кроме этого, цГМФ-зависимая протеинкиназа G активирует фосфатазу легких цепей миозина, дефосфорилирующую головки миозина (см. лекцию 10). Дефосфорилированный миозин теряет способность образовывать поперечные мостики с актином. В результате тонус гладкомышечных клеток падает, сосуды расслабляются, сопротивление кровотоку в них понижается. Недавно обнаружен и цГМФ-независимый механизм расслабления гладких мышц, обусловленный прямым влиянием NO (нитрозилированием) на сократительные белки гладкомышечных клеток, что активирует фосфатазы, ответственных за дефосфорилирование легких цепей миозина

Небольшие количества NO, продуцируемые неповрежденным эндотелием под влиянием конститутивной NOS поддерживают артериальные сосуды в состоянии дилатации. Ингибиторы синтеза NO вызывают сужение сосудов и существенное повышение системного артериального давления. Недавно были проведены испытания действия ингибиторов NO-синтазы на здоровых нормотензивных добровольцах. Оказалось, что ингибиторы вызывают весьма значительный подъем артериального давления у людей (приблизительно на 25 мм ртутного столба). Наоборот, назначение больным первичной гипертензией предшественника образования NO в организме - L-аргинина в виде пищевой добавки по 500 мг в сутки в течение 1 месяца повышало на 50-100% образование NO у этих больных, что сопровождалось снижением артериального давления до нормальных величин.

Малые физиологические концентрации NO (<10^{-6 М) оказывают цито- и нейропротекторное действие}. Связано это с тем, что монооксид азота является относительно долгоживущим слабым радикалом, который эффективно перехватывает гораздо более опасные радикалы, такие как супероксидный (O₂^.-), гидроксильный (.OH), тиильный (напр. .GS) липопероксильный (.LOO) и др. Однако, относительно большие концентрации NO в тканях (>10^{-6 М), выделяющиеся при интенсивном возбуждении нейронов либо при активации макрофагальной} NOS чужеродными агентами могут вызывать повреждение собственных клеток. В первую очередь при этом ингибируются дыхательные ферменты митохондрий, затем происходит фрагментация ДНК, нитрованиебелков и биогенных моноаминов, а также перекисное окисление липидов. Во многом эти процессы обусловлены образованием весьма токсичного пероксинитрита (ONOO^-). Пероксинитрит, образующийся при взаимодействии NO с О₂^- дает начало большому количеству оксидантов, играющих значительную роль в гибели нейронов. Важным фактором, препятствующим развитию NO-зависимых окислительных процессов в клетках является СОД. При повышении концентрации NO^. до 2—4 мкМ, как это имеет место при ишемии мозга, или даже до 10 мкМ, как это бывает в непосредственной близости от активированных макрофагов способность супероксиддисмутазы конкурировать с NO^. за супероксид анион резко падает и синтез ONOO^- увеличивается.

Превращение NO^. из физиологического регулятора в токсический агент происходит в результате взаимодействия NO. c супероксид анионом и образования ONOO^-, который, протонируется и распадаясь в процессе диффузии от места его образования на ОН^- и NO₂, буквально сокрушает на своем пути самые различные биомолекулы и биомембраны.

ONOOН ==> ОН^. + NO₂ (5),

Возможно прямое взаимодействие ONOO^- с белками

ONOO^- + метал ==> NO⁺² ...O^- - - - - - метал > белок - - - - тирозин - - - - NO₂ + HO-метал¹⁺ + метал ²⁺ + Н₂О (7)

Главным следствием этой реакции является модификация тирозиновых остатков белковых молекул. Важно, что главный удар ONOO^- наносит именно по тирозину. Это приводит к деструкции не только многих ферментных и структурных систем, но и блокированию клеточной сигнализации, опосредуемой тирозинкиназой, так как образующийся в ходе реакции нитротирозин очень напоминает фосфотирозин, необходимый для этой цели.

В начале эры монооксида азота считали, что эта сигнальная молекула не накапливается в тканях, а действует локально и кратковременно. Предполагалось, что NO действует только в момент синтеза выделяясь из клеток, где функционирует NOS, влияя только на близлежащие клетки. Сейчас установлено, что NO эффективно запасается некоторыми белками и может транспортироваться с ними далеко от места генерации. Например, аффинность взаимодействия гемоглобина с NO в 8000 раз превышает таковую с О₂. При этом образуются либо комплексы NO с гемом (Hb-NO), либо ковалентное нитрозилирование по SH группами белка (SNO-Hb). Это взаимодействие не уничтожает биологическую активность монооксида азота, поскольку эти реакции обратимы (при изменении рО₂, рН, редокс потенциала среды), а способствует ее консервации и транспортировке. Показано, что при активации макрофагальной iNOS бактериальными эндотоксинами в крови увеличивается концентрация S-нитрозогемоглобина и нитрозоальбумина в 10-ки раз. Возможно, именно этим объясняются характерные системные изменения в самочувствии при развитии инфекционных заболеваний.

Фармакологические препараты, изменяющие уровень NO в организме, использовались в медицине задолго до понимания механизмов их действия. Например, метиленовый синий (ингибитор NO-синтазы и гуанилатциклазы) применяют уже более 100 лет для коррекции маниакально-депрессивных состояний. В ряде работ показано, что монооксид азота является антагонистом дофамина и норадреналина в мозге и, вероятно, снижение активности этого газа в мозге действует на таких больных благоприятно. Также давно используется для лечения грудной жабы (стенокардии) нитроглицерин. Этот препарат внутри гладкомышечных клеток (в т.ч. в коронарных сосудах) взаимодействует с SH-группами образуя нитрозотиолы из которых затем выделяется NO.

Одной из самых популярных в США пищевых добавок является L-аргинин. - это одна из двадцати аминокислот, которые участвуют в образовании белков. Аргинин- это незаменимая аминокислота для детей (для взрослых - заменимая), т.е. организм ребенка сам не может создавать такую аминокислоту, а должен получать ее с пищей. Врачам и спортсменам давно известно, что L-аргинин является эффективным стимулятором продукции соматотропного гормона гипофиза (СТГ). Аргинин стимулирует СТГ, блокируя секрецию ингибитора гормона роста соматостатина вследствие увеличенного синтеза NO. ГРспособен увеличить мышечную и уменьшить жировую массу тела (является антагонистом инсулина, который стимулирует отложение жира), в конечном результате делая фигуру более стройной;

L-аргининобладает замечательным психотропным эффектом. Вызывая увеличение до верхних нормальных границ соматотропного гормона L-аргинин способствует улучшению настроения, делает человека более активным, инициативным и выносливым

L-аргининиспользуется в профилактике и лечении гипертонической болезни. В дозах 2-3 грамма в день L-аргинин способствует уменьшению тонуса гладкой мускулатуры артерий, тем самым снижая уровень диастолического кровяного давления; Обладает и рядом других благоприятных эффектов – ранозаживляющим, иммуностимулирующим, противоопухолевым. Семенная жидкость очень богата L-аргинином. При недостатке этой аминокислоты в питании детей у них замедляется половое созревание;

L-аргининэффективен для интенсификации сперматогенеза, что используется для лечения бесплодия у мужчин;

Применение аргинина в качестве анаболической аминокислоты и стимулятора иммунной системы широко распространилось в 1982 году, благодаря книге Дарка Пирсона (Durk Pearson) и Сэнди Шоу (Sandy Shaw) Life Extension ("Продление жизни"). В этой книге Сэнди описала, как она с целью ускорения срастания костей и тканей в сломанной стопе принимала перорально по 10 грамм L-аргинина на пустой желудок. В качестве побочного эффекта, как говорится в книге, она потеряла 11 кг жира, одновременно набрав 2,5 кг мышц за шесть недель. Оба автора объясняют эффект значительного улучшения композиции тела Сэнди повышением уровня высвобождения гормона роста, которое произошло благодаря приему аргинина.

Результаты исследований, представленные в 1995 году на встрече Американской Сердечной Ассоциации, сообщают, что у престарелых людей, потреблявших аргинин в качестве пищевой добавки, восстановилась утраченная с возрастом эластичность кровеносных сосудов. По мере старения организма происходит повреждение эндотелия, что вызывает местную нехватку оксида азота. Аргинин восстановил синтез оксида азота в кровеносных сосудах, а это привело к их расширению и возвращению эластичности. В ходе другого эксперимента было отмечено, что получение крысами L-аргинина ослабило негативное влияние гипертонии (высокого кровяного давления) на сердечную функцию.

В большинстве клеток-мишеней механизмом, ограничивающим длительность и силу NO/цГМФ-зависимых воздействий, является активация цГМФ-специфичной фосфодиэстеразы (ФДЭ 5). Были синтезированы специфические ингибиторы этого фермента (силденафил, запринаст), которые в настоящее время под различными коммерческими названиями применяются для лечения сексуальной дисфункции у мужчин и женщин.

Лекция 13-14