Из растительного сырья. Методы выделения поли- и олигосахаров,прежде всего, зависят от таких свойств

Методы выделения поли- и олигосахаров,прежде всего, зависят от таких свойств, как растворимость и лабильность к различным реагентам.

В подавляющем большинстве случаев различные полисахариды извлекают водой при комнатной или повышенной температуре, причем повышение температуры приводит к увеличению растворимости большинства полисахаридов.

Различная растворимость полисахаридов в воде иногда позволяет провести их фракционное извлечение. Так, при извлечении крахмала теплой водой в раствор переходит амилоза; сильно разбухающий и более высокомолекулярный амилопектин переходит в раствор лишь в очень малой степени. Для кислых полисахаридов, например сульфатированных полисахаридов, извлечение целесообразно вести разбавленными минеральными кислотами, которые вытесняют их из соответствующих солей.

Крепкими горячими растворами щелочей иногда пользуются для извлечения полисахаридов с одновременной подготовкой к освобождению от белков, переходящих в щелочные альбуминаты и продукты щелочного расщепления, не осаждающиеся спиртом. Недостатком метода является частич-ная деполимеризация полисахаридов. Иногда для извлечения полисахаридов пользуются другими растворителями например, DМSО.

Извлеченные полисахариды затем осаждают. При этом полисахариды не только осаждаются, но и очищаются от низкомолекулярных примесей, в частности минеральных солей, моносахаридов и низших олигосахаридов. В качестве осадителя чаще всего пользуются этиловым спиртом. При концентрации спирта порядка 80% и выше большинство полисахаридов выпадает в осадок, а низкомолекулярные примеси остаются в растворе. Постепенно прибавляя спирт и выделяя осадки, выпадающие при повышающихся концентрациях спирта, удается провести фракционное осаждение полисахаридов.

В некоторых случаях осаждение полисахаридов проводится солями. При осаждении нейтральных полисахаридов используется понижение их растворимости в присутствии нейтральных солей (например, (NH₄)₂SO₄). При осаждении кислых полисахаридов, как, например, альгиновой или пектовой кислот, используется образование плохо растворимых в воде бариевых или кальциевых солей этих полисахаридов. Этот ме-тод позволяет разделить кислые и нейтральные полисахариды.

Соли четвертичных аммониевых оснований с длинноцепо-чечным радикалом, весьма успешно используются для разделе-ния и фракционирования кислых и нейтральных полисахаридов. Катионы этих солей, как, например бромид цетилтриметил-аммония и хлорид цетилпиридиния, образуют соли с анионными группировками (сульфатными и карбоксильными) кислых поли-сахаридов, а длинноцепочечный радикал катионов, вследствие своей гидрофобности, способствует выпадению осадков.

Полисахариды образуют медные комплексы при осаждении раствором Фелинга (свежеприготовленный Cu(OH)₂ в среде тартрата натрия). При наличии в моносахаридных остатках полисахарида двух цис- гидроксигрупп ион “Cu²⁺” замещает атомы водорода этих гидроксигрупп, образуя не растворимое в воде соединение. Способ очень удобен для выделения маннанов и глюкоманнанов, обладающих цис-гидроксигруппами у С-2 и С-3 маннозных остатков. Последующее разложение медных комплексов полисахаридов проводят уксусной кислотой, после чего полисахариды осаждают спиртом. Необходимо, однако, подчеркнуть, что применение реактива Фелинга, содержащего крепкую щелочь, и уксусной кислоты в процессе регенерации полисахарида может привести к частичной деградации и деполимеризации исходного полисахарида. Так, например, щелочная обработка способствует гидролизу сложноэфирной связи непрочных ацетильных групп.

Примесь белков удаляется при помощи трихлоруксусной кислоты. Для этого полисахарид растворяют в 5-10% трихлоруксусной кислоте, отделяют белковый коагулят центрифугированием, а затем полисахарид осаждают из раствора спиртом. Метод хорош для освобождения от белков, но не безразличен для полисахаридов, вызывая их некоторую деполимеризацию. Более щадящим является метод Севага: при обработке раствора полисахарида хлороформом с амиловым спиртом белок отделяется на поверхности раздела хлороформ-водный раствор [118].

ФЕНОЛЫ

Все содержащиеся в лекарственных растениях фенолы образуются из углеводов и продуктов их превращения. По числу ОН-групп определяется атомность фенолов. В растениях преобладают 2-х и 3-х атомные фенолы.

Все фенолы – кислоты, растворимы в воде и водно-органических смесях, спиртах, ацетоне.

 

Выделение:

Около 1 г измельченного растительного сырья заливают 10 мл воды очищенной или спирта этилового 10-30%, кипятят в течение 30-40 мин, фильтруют.

Для качественного анализа используют по 1-3 мл.

 

Качественных реакций, селективных для фенолов не существует, родственные соединения извлекаются вместе с фенолами [10-12,70].

q Добавляют 1-3 капли бромтимолового голубого, появляется желтое окрашивание на голубом фоне (феноло-кислоты, фенолы, полифенолы).

q Добавляют 1-3 капли бромкрезолового зеленого, появля-ется желтое окрашивание на зеленом или сине-зеленом фоне (фенолокислоты, фенолы).

q Реакция Бейт-Смита и Уэстолла. Добавляют 1-3 капли 1% аммиачного раствора серебра азотнокислого, появляется окрашивание от желтого до темно-коричневого (феноло-кислоты).

q Добавляют 1-2 мл 2% раствора свинца ацетата основного, появляется осадок или окрашивание: желтое или оранжевое (фенолы, фенолокислоты, полифенолы, дубильные вещества).

q Реакция Робертса и Вуда. Добавляют 1-5 капель 0.2% раствора квасцов железоаммониевых, появляется зеленое окрашивание (орто-диоксигруппировка любых фенольных соединений); синее до фиолетового окрашивание (три рядовых ОН-группы любых фенольных соединений).

q Реакция Запрометова. Добавляют 1-3 капли 1% раствора ванилина в кислоте хлороводородной концентри-рованной, появляются оттенки красного цвета (мета-диоксигруппировка любых фенольных соединений).

q

Добавляют несколько капель 5% спиртового раствора кислоты фосфорномолибденовой (свежеперегнанной!), появля-ется синее окрашивание (полифенолы).

q Добавляют 1-3 мл 1-5% раствора железа окисного хлорида, появляется различное окрашивание зеленых, синих, фиолетовых оттенков (любые фенольные соединения, кроме тимола).

q Добавляют кристаллик сульфата железа закисного, появляется сиреневое, за­тем темно-фиолетовое окрашивание, а затем темно-фиолетовый осадок (флороглюцины).

q Добавляют 3-5 капель раствора 1% железа окисного хлорида и 3-5 капель 1% раствора калия ферроцианида, появляется темно-зеленое окрашивание. При добавлении 3-5 капель раствора кислоты азотной концентрированной, появляется темно-бурое окрашивание (фенолы, полифенолы).

q Добавляют 2-3 капли реактива Паули по Кутачеку (3 г сульфаниламида растворяют в 200 мл воды, добавляют 6 мл концентрированной кислоты хлороводородной и 14 мл н-бутилового спирта. Перед употреблением 20 мл этого раствора смешивают с 0.3 г натрия нитрита), появляется вишнево-красное окрашивание, переходящее в оранжевое (флороглюциды, арбутин).

q Реакция Либермана. Добавляют 0.1 г натрия нитрита в 5 мл кислоты хлороводородной, появляются различные окрашенные осадки и растворы соответствующих индофенолов.

q В парах йода на БХ появляются коричневые пятна (оксикоричные кислоты).

q Добавляют 1 мл 1% раствора ферроцианида калия и 1 мл железоаммониевых квасцов, появляется темное или синее окрашивание (фенолокислоты, окси-, ди- и трикарбоновые кислоты, двух- и трехатомные фенолы).

q Добавляют 1-2 мл кислоты хлороводородной концентрированной и 1-2 мл 10% раствора натрия нитрита, появляется меняющееся окрашивание: оранжево-желтое ® оранжево-красное ® кроваво-красное с зеленым оттенком ® смородиново-красное (двух- и трехатомные фенолы, производные салициловой кислоты).

q Добавляют 2 мл аммиака концентрированного, 1 мл 10% раствора натрия фосфорно-молибденового в 10% кислоте хлороводородной, появляется синее окрашивание (арбутин).

 

Хроматографический анализ фенольных соединений растения может быть осуществлен как хроматографией на бумаге или в тонком слое, так и приборными методами: ГЖХ, ЖЖХ, ВЭЖХ. Применение хроматографического анализа в изучении отдельных классов полифенольных соединений и фенольных гликозидов было описано нами по группам БАВ в предыдущих главах книги. Однако для исследования «первого» общего экстракта растения, обычно содержащего большое количество компонентов различной природы, когда исследователю еще не известен даже предположительный состав объекта исследования, тем не менее можно предложить несколько общих для фенолов хроматографических систем. Так, при исследовании фенолов различной природы методом хроматографии на бумаге, хорошо зарекомендовали себя следующие системы:

1) н-бутанол – уксусная кислота – вода (40:12.5:29 и 4:1:5 органический слой)

2) 2, 6 или 15% уксусная кислота

3) фенол, насыщенный водой

4) этилацетат, насыщенный водой

Для ВЭЖХ хроматографии, в случае исследования общих полифенольных экстрактов растений была разработана следующая система: колонка с YMC-Pack ODS-AP сорбентом, и подвижной фазой ацетонитрил-вода (4:1). В работе предлагается использовать УФ детектор при длинах волн 254 и 276 нм [119]. Другой оригинальной хроматографической системой, предназ-наченной для препаративного выделения веществ общих экстрактов является: колонка с LiChrosorbSi 60 + хлороформ-метанол (9:1) в качестве подвижной фазы, с использованием фотодиодного детектора [120].

 

Количественно полифенолы определяют по методу 1:

Около 1 г (точная навеска) содержимого капсул (драже, таблеток) или 2 г измельченного растительного сырья помещают в коническую колбу вместимостью 100 мл, прибавляют 50 мл воды очищенной и кипятят на водяной бане в течение 2 часов.

Смесь охлаждают и фильтруют в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят объем водой очищенной до метки, перемешивают. [5 мл полученного раствора помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, доводят объем водой очищенной до метки, перемешивают.] *

5 мл полученного раствора помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, прибавляют 1 мл раствора кислоты вольфраматофосфорной, доводят объем 15% раствором натрия карбоната до метки, перемешивают.

Измеряют оптическую плотность полученного раствора через 2-3 мин. после прибавления последнего реактива при длине волны 715 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм, используя в качестве раствора сравнения воду очищенную.

Параллельно измеряют оптическую плотность СО пирогаллола, точно через 2 минуты после прибавления последнего реактива и в течение 15 минут после растворения пирогаллола.

Содержание суммы полифенолов, в пересчете на пирогаллол, в процентах (Х) вычисляют по формуле:

 

X =

X =

D₁ ^. m₀ ^. 100 ^. [25] ^. 50 ^. 5 ^. 5 ^. 100 ^. [100]

D₀ ^. m₁ ^. [5] ^. 5 ^. 100 ^. 100 ^. 50 ^. [(100 - W)]

 

где D₁– оптическая плотность анализируемого раствора при длине волны 715 нм;

D₀ - оптическая плотность раствора СО пирогаллола при длине волны 715 нм;

m₁ – масса измельченного лекарственного растительного сырья или лекарственного средства, в граммах;

m₀ – масса навески СО пирогаллола – 0.0500 г;

W – потеря в массе при высушивании сырья, в процентах.

* при необходимости разбавляют испытуемый раствор.

Примечания. Приготовление раствора СО пиро-галлола. 0.050 г (точная навеска) пирогаллола высшей очистки помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяют в воде очищен-ной, доводят объем водой очищенной до метки и перемешивают.

5 мл полученного раствора помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят объем водой очищенной до метки и перемешивают.

5 мл полученного раствора помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, прибавляют 1 мл раствора кислоты вольфраматофосфорной, переме-шивают, доводят объем до метки 15% раствором натрия карбоната, перемешивают.

Раствор готовят в защищенном от света месте!

Приготовление раствора кислоты вольфра-матофосфорной. К 10 г натрия вольфрамата прибавляют 8 мл кислоты фосфорной 85%, 75 мл воды очищенной и нагревают в течение 3 часов с воздушным холодильником. Затем охлаждают и доводят объем водой очищенной до 100 мл, перемешивают.

В качестве СО может быть использован любой фенол или фенолокислота, аналогичные содержащимся в сырье.

 

Определение общего содержания фенолов в жидких лекформах можно проводить по методике:

В мерную колбу вместимостью 25 мл помещают 5 мл испытуемого раствора препарата, 10 мл спирта этилового 30%, 1.5 мл 3% раствора железа окисного хлорида, 10 мл 5% раствора натрия карбоната, доводят до метки водой очищенной, взбалтывают. Оставляют на 20 мин при комнатной температуре, а затем центрифугируют при скорости 5000 об/мин в течение 10 мин в центрифужной пробирке вместимостью 15 мл. Измеряют поглощение надосадочной жидкости при длине волны 720 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм в сравнении с водой очищенной.

25 мл испытуемого раствора имеют при указанных условиях поглощение 0.276, в пересчете на 0.05 мг стандартного раствора эпикатехина.

Общее содержание фенолов в процентах (X) рассчитывают по формуле:

 

X =

X =

D ^. 0.05 ^. 100

0.276 ^. d ^. 5 ^. 1000

 

где D - оптическая плотность надосадочной жидкости при длине волны 720 нм.

 

В настойке прополиса (80% спирт) сумму фенольных соединений определяют из 1 мл, разбавленного спиртом этиловым 96%, в колбе на 100 мл.

Оптическую плотность полученного раствора измеряют при длине волны 290 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм на фоне спирта этилового 96%.

Содержание суммы фенольных соединений в препарате в процентах вычисляют по формуле:

 

X =

X =

D ^. 100

510 ^. 1

 

где D - оптическая плотность испытуемого раствора при длине волны 290 нм;

510 - коэффициент пересчета оптической плотности испытуемого раствора и содержания суммы фенольных соединений прополиса при длине волны 290 нм [7,121].