Микотоксины и методы их определения

Микотоксины (от греч. mykes — гриб и toxikon — яд) — это вторичные метаболиты микроскопических плесневых грибов, обладающие выраженными токсическими свойствами. Высокая опасность микотоксинов выражается в том, что они обладают токсическим эффектом в чрезвычайно малых количествах и способны весьма интенсивно диффундировать в глубь продукта.

Афлатоксины являются представителями наиболее опасной группы мико­токсинов, обладающих сильными гепатотоксилескими и канцерогенными свойст­вами. Продуцентами афлатоксинов являются различные штаммы только двух видов аспергилл (Aspergillus flavus и Aspergillus parasiticus), которые широко распространены во всем мире. Следует отметить, что токсигенные грибы могут поражать растительные субстраты не только во время хранения, но и в процессе их роста, сбора урожая, транспортирования и переработки.

Семейство афлатоксинов включает четыре основных представителя (афла­токсины В ₁, В₂, G₁, G₂), а также более 10 соединений, являющихся производными или метаболитами основной группы (М₁, М₂, В_2а, G_2а, GM₁, Р₁, Q₁ и др.).

В природных условиях чаще и в наибольших количествах афлатоксины обнаруживаются в арахисе, кукурузе, семенах хлопчатника. Кроме того, в зна­чительных количествах они могут накапливаться в различных орехах, семенах масличных культур, пшенице, ячмене, зернах какао и кофе, а также в кормах для сельскохозяйственных животных.

Следует отметить возможность появления афлатоксинов в продуктах жи­вотного происхождения: в молоке, тканях и органах животных, получавших корм, загрязненный афлатоксинами в высоких концентрациях.

Доказано, что коровы экскретируют с молоком от 0,35 до 2-3 % получен­ного с кормом афлатоксина В₁ в виде высокотоксичного метаболита — афлатоксина М₁ При этом пастеризация молока и процесс высушивания не оказывают существенного влияния на содержание в нем афлатоксина М₁. Афлатоксин М₁ был обнаружен как в цельном, так и в сухом молоке и даже в молочных продуктах, подвергшихся технологической обработке (пастеризация, стерилизация, приготовление творога, йогурта, сыров и т. п.). Так, в процессе получения сыра из контаминированного молока 50 % афлатоксина М₁определяется в творожной массе. При получении масла 10 % афлатоксина М₁ переходит в сливки, 75 % ос­тается в снятом молоке.

Афлатоксины слабо растворимы в воде, нерастворимы в неполярных рас­творителях, но легко растворимы в растворителях средней полярности, таких как хлороформ, метанол и диметилсульфоксид. Они достаточно нестабильны в химически чистом виде и чувствительны к воздействию воздуха и света.

Афлатоксины практически не разрушаются при ооычнои кулинарной оораоотке кон-таминированных пищевых продуктов.

Трихотеценовые микотоксины являются вторичными метаболитами мик­роскопических грибов рода Fusarium, которые поражают корма и пищевые про­дукты, вследствие чего у животных и человека возникает алиментарный токси­коз. Чаще всего они обнаруживаются в зерне кукурузы, пшеницы и ячменя. Ми­котоксины этой группы отличаются повсеместным распространением, особенно в странах с умеренным континентальным климатом. Нередко в одном и том же продукте обнаруживают два или более микотоксинов. При проведении обяза­тельной сертификации предусмотрен контроль за содержанием двух представи­телей этой грутпты, а именно нормируются дезоксиниваленол и Т-2 токсин.

Дезоксиниваленол (ДОН) — один из распространенных фузариотоксинов — подавляет синтез белка, снижает концентрацию итгуногаобулинов в сыворотке крови, может подавлять ре1фодуктивную систему. Особенно опасным является загрязнение кормов для сельскохозяйственных животных. Так, ДОН вызывает у животных рвоту, снижает потребление корма у поросят. Т-2 токсин распростра­нен менее широко, но более токсичен, чем ДОН. Т-2 токсин вызывает раздраже­ние, кровоизлияния и некроз в пищеварительном тракте. Острая интоксикация трихотеценами сопровождается поражением органов кроветворения и иммуно-компетентных органов. Характерны развитие геморрагического синдрома, отказ от корма, рвота.

Зеараленон и его производные также продуцируются микроскопическими грибами рода Fusarium. Основным природным субстратом, в котором наиболее часто обнаруживается зеараленон, является кукуруза. Грибы рода Fusariurn gra-minearum часто поражают кукурузу в поле на корню и являются причиной гнили початков и стеблей. Контаминация кукурузы зеараленоном может происходить и при хранении. Высока частота обнаружения зеараленона в комбикормах, а так­же в пшенице, ячмене и овсе. Среди пищевых продуктов этот токсин был обна­ружен в кукурузной муке, хлопьях и кукурузном пиве.

Зеараленон обладает выраженным эстрогенным и тератогенным действи­ем и представляет серьезную проблему для животноводства во многих странах, а способность этого микотоксина накапливаться в тканях сельскохозяйственных животных делает его потенциально опасным для здоровья человека. Загрязне­ние кормов зеараленоном вызывает снижение плодовитости, аборты, бесплодие и воспалительные заболевания у свиней, коров, до­машней птицы и кроликов. Несмотря на это, неко­торые производные зеараленона до последнего вре­мени использовались в качестве стимуляторов роста животных и достаточно широко производились про­мышленностью.

Патулин — особо опасный микотоксин, обладающий канце­рогенными и мутагенными свойствами. Основными продуцентами патулина являются микроскопические грибы Penicillium patulum и Penicillium expansum. Продуценты патулина поражают в основном фрукты и некоторые овощи, вызывая их гниение. Патулин обнаружен в яблоках, грушах, абрикосах, персиках, вишне, винограде, бананах, клубнике, голубике, бруснике, облепихе, айве, томатах. Наиболее часто патулином поражаются яблоки, где содержание токсина может доходить до 17,5 мг/кг. Следует отметить, что патулин обнаруживают не только в подгнив­шей части фруктов и овощей, но и в нормальной. Например, в томатах патулин распределяется равномерно по всей ткани.

Патулин в высоких концентрациях обнаруживается и в продуктах переработ­ки фруктов и овощей: соках, компотах, mope и джемах. Особенно часто его находят в яблочном соке (0,02-0,4 мг/л). Содержание патулина в других видах соков: груше­вом, айвовом, виноградном, сливовом, манго — колеблется от 0,005 до 4,5 мг/л.

Контроль за содержанием микотоксинов является обязательным при прове­дении сертификации продовольственного сырья и пищевых продуктов. В России приняты санитарно-гигиенические нормативы по содержанию микотоксинов в продуктах питания, приведенные в табл. 12.

Система мер профилактики микотоксикозов включает санитарно-микологический анализ пищевых продуктов (рис. 13).

Таблица 12. Допустимые уровни содержания микотоксинов в отдельных группах пищевых продуктов

Кроме того, большое внимание уделяется изысканию способов деконтаминации и детоксикации сырья и пищевых продуктов, загрязнешгых микотоксинами. С этой целью используют механические, физические и химические методы:

1) механические — отделение загрязненного материала вручную или с по­мощью электронно-калориметрических сортировщиков;

2) физические термическая обработка, облучение ультрафиолетовой ра­диацией;

3) химические — обработка растворами окислителей, сильных кислот и ос­нований.

Однако применение механических и физических методов очистки не дает высокого эффекта, химические методы приводят к разрушению не только мико­токсинов, но и полезных нутриентов, а также к нарушению их всасывания.

Рис. 12.Санитарно-микробиологический анализ пищевых продуктов

14.8.1 Методы определения микотоксинов

Современные методы обнаружения и определения содержания микотокси­нов в пищевых продуктах и кормах включают скрининг-методы, количествен­ные аналитические и биологические методы.

Скрипипг-методы отличаются быстротой и удобны для проведения се­рийных анализов, позволяют быстро и надежно разделять загрязненные и не­загрязненные образцы. К числу скрининг-методов относятся методы тонкослой­ной хроматографии (ТСХ-методы), флуоресцентный метод определения зерна, загрязненного афлатоксинами.

Количественные аналитические методы определения микотоксинов представлены химическими, радиоиммунологическими и имлгуноферментны-ми методами. В настоящее время наиболее распространенными являются хими­ческие методы, включающие две стадии: стадию выделения и стадию количес­твенного определения микотоксинов. Стадия выделения включает экстракцию (отделение микотоксина от субстрата) и очистку (отделение микотоксина от со­единении с близкими физико-химическими характеристиками). Окончательное разделение и количественное определение микотоксинов проводится с помощью различных хроматографических методов. Универсалыгым методом определения всех видов микотоксинов является тонкослойная хроматография (ТСХ).

При отборе проб из партии продукта основной задачей является получение среднего образца или средней пробы, по концентрации микотоксинов являющей­ся представительной для всей партии (отобранные образцы должны характери­зовать качество всей партии). Выполнение этой задачи зависит от природы и рас­пределения микотоксинов, характеристики продукта (сырой, обработанный, сы­пучий, жидкий, пастообразный и т. д.), способа подготовки образца. Например, загрязнение арахиса афлатоксинами имеет выраженный гетерогенный характер:

в отдельных зернах арахиса их содержание может колебаться от тысячных долей миллиграмма до десятков и более миллиграммов на 1 кг, т. е. различаться на 5-6 порядков. По этой причине вклад ошибки при отборе пробы в общую ошиб­ку анализа при определении афлатоксинов в арахисе является основным и в ряде случаев может составлять более 90 %.

С точки зрения однородности загрязнения микотоксинами вес продукты можно разделить на две группы: 1) продукты с высокой степенью неоднороднос­ти (очищенный и неочищенный арахис, масличные семена, целые или грубомолотыс зерна, орехи); 2) продукты с однородным характером загрязнения (жид­кости: молоко, растительные масла, соки, шоре; мука, размолотые шроты).

Для получения представительного среднего образца продуктов 1-й группы размер исходного образца должен быть максимально возможным (не менее 2 кг), при этом средний лабораторный образец следует выделять из перемолотого (го­могенизированного) среднего образца.

Для однородных продуктов 2-й группы (джем, повидло, фруктовые соки в мелкой жестяной таре, сгущенное молоко, сухие молочные продукты и др.) пробы следует отбирать в количестве единиц упаковки, соответствующих вели­чине среднего образца (100 200 г), при условии, что продукт происходит из од­ной партии.

Химические методы обнаружения и идентификации отдельных афлатокси­нов основаны на их специфической флуоресценции в УФ-свете (около 365 нм), на различиях в подвижности при тонкослойной хроматографии, на специфич­ности их спектров поглощения и флуоресценции.

В отличие от афлатоксинов трихотецены не обладают поглощением или флуоресценцией в видимой части спектра, что затрудняет их обнаружение при тонкослойной хроматографии. Однако выявить трихотецены с помощью ТСХ возможно при использовании методов, основанных на обработке ТСХ-пластин специальными реагентами, которые образуют с трихотеценами окрашенные или флуоресцирующие производные. Например, Т-2 токсин при обработке пластин концентрированной серной кислотой образует пятна с голубой флуоресценцией в УФ-свете.

Арбитражными методами количественного определения микотоксинов яв­ляются следующие:

• газожидкостная хроматография (для Т-2 токсина);

• высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) с использова­нием УФ-фотомстрического детектора (для дезоксиниваленола и патулина);

• ВЭЖХ с использованием флуоресцентного детектора (для афлатоксипов и зеараленона).

Для анализа микотоксинов чаще применяются градиентные системы ВЭЖХ, где в качестве подвижной фазы используются растворы ацетонитрила в воде с линейно изменяющейся во времени концентрацией.

Хроматографическая колонка представляет собой металлическую трубку длиной от 150 до 250 мм с внутренним диаметром 4,6 мм, заполненную специаль­ным сорбентом на основе силикагеля с привитыми углеводородными радикалами. Предколонка служит для защиты хроматографической колонки от загрязнений.

УФ-фотомеорический детектор является наиболее распространенным ви­дом детекторов для ВЭЖХ. Принцип действия детектора аналогичен принципу действия обычного спектлзофотометра: он регистрирует оптическую плотность раствора. Различие состоит в том, что УФ-детектор является проточным, вместо кюветы с раствором в нем используется фотометрическая ячейка. Поток элюен-та протекает через рабочую ячейку, а через сравнительную ячейку направляется поток чистой подвижной фазы. Источником света служит ртутная лампа, дающая интенсивное УФ-излучение. Свет с нужной длиной волны выделяется с помощью подходящих оптических фильтров, проходит через ячейки, частично поглощается молекулами подвижной фазы и разделяемых компонентов и улавливается фото­приемником. Светопоглощение (оптическую плотность) элюата непрерывно ре­гистрирует самописец или компьютер, записывая хроматограмму. Разделяемые компоненты смеси (например, микотоксины) представлены на хроматограмме в виде пиков. Положение пика на хроматограмме используют для идентификации вещества, а площадь пика — для количественного определения.

Более сложное устройство представляет собой флуоресцентный (флуори­метрический) детектор. Такой детектор использует способность органических соединений, в частности афлатоксинов и зеараленона, флуоресцировать под действием УФ- или видимого излучения. Флуоресцентный детектор имеет про­точную ячейку с двумя взаимно перпендикулярными оптическими каналами. Один из них служит для подвода возбуждающего излучения, другой позволяет измерять интенсивность флуоресценции. В случае анализа афлатоксинов В₁и М₁ длина волны возбуждающего излучения составляет 360 нм, а длина волны ис­пускаемого излучения — 420 нм.

Следует отметить, что для анализа афлатоксинов можно применять также УФ-детектор, однако его чувствительность на порядок ниже, чем у флуоримет-рического детектора, поэтому при анализе низких концентраций афлатоксинов (на уровне ПДК и ниже) предпочтительным является флуоресцентное детекти­рование.