Прямое определение наличия возбудителей

Многие традиционные методы диагностики, например иммуноферментный анализ, выявляют белки-маркеры, являющиеся продуктами жизнедеятельности инфекционных агентов, что дает лишь опосредованное свидетельство наличия инфекции. Выявление специфического участка ДНК возбудителя методом ПЦР дает прямое указание на присутствие возбудителя инфекции.

2. Высокая специфичность.

Высокая специфичность метода ПЦР обусловлена тем, что в исследуемом материале выявляется уникальный, характерный только для данного возбудителя фрагмент ДНК. Специфичность задается нуклеотидной последовательностью праймеров, что исключает возможность получения ложных результатов, в отличие от метода иммуноферментного анализа, где нередки ошибки в связи с перекрестно-реагирующими антигенами.

3. Высокая чувствительность.

Метод ПЦР позволяет выявлять даже единичные клетки бактерий или вирусов. Теоретически для осуществления реакции достаточно всего одной копии искомой ДНК (РНК) -последовательности в исследуемом материале, что позволяет использовать ее даже в тех случаях, когда серологические и бактериологические исследования не дают положительного результата вследствие крайне низкого микробного титра (например при контроле инфекционной безопасности донорской крови и органов, диагностике хронических и латентных инфекций).

4. Универсальность процедуры выявления различных возбудителей.

Материалом для исследования методом ПЦР служит ДНК возбудителя. Метод основан на выявлении фрагмента ДНК или РНК, являющегося специфичным для конкретного организма. Сходство химического состава всех нуклеиновых кислот позволяет применять унифицированные методы прове­дения лабораторных исследований. Это дает возможность диагностировать несколько возбудителей из одной биопробы. В качестве исследуемого материала могут использоваться различные биологические выделения (слизь, моча, мокрота), соскобы эпителиальных клеток, кровь, сыворотка.

5. Высокая скорость получения результата анализа.

Для проведения ПЦР-анализа не требуется выделение и выращивание культуры возбудителя, что занимает большое количество времени. Это особенно заметно при исследовании медленнорастущих микроорганизмов. Однако даже в случае быстрорастущих культур оперативность ПЦР может быть полезной. Например, выделение, идентификация и определение лекарственной устойчивости у штаммов метициллинрезистентного золотистого стафилококка (MRSA) с помощью традиционных микробиологических методов требуют не менее 3-5 дней, в то время как ПЦР-анализ позволяет выявить MRSA менее чем за сутки.

6. Возможность диагностики не только острых, но и вялотекущих, скрытых инфекций.

Особенно эффективен метод ПЦР для диагностики труднокультивируемых, некультивируемых и персистирующих форм микроорганизмов, с которыми часто приходится сталкиваться при латентных и хронических инфекциях, поскольку этот метод позволяет избежать сложностей, связанных с выращиванием таких микроорганизмов в лабораторных условиях. Применение ПЦР-диагностики также очень эффективно в отношении возбудителей с высокой антигенной изменчивостью и внутриклеточных паразитов. Методом ПЦР возможно выявление возбудителей не только в клиническом материале, полученном от больного, но и в материале, получаемом из объектов внешней среды (вода, почва и т.д.).

Однако следует отметить, что метод ПЦР лишь дополняет спектр традиционных методов, используемых в микробиологической диагностике. Наиболее рационально и эффективно применение ПЦР для обнаружения микроорганизмов, трудно-выявляемых в лабораторных условиях, атипичных форм бактерий. К ним также относятся внутриклеточные паразиты и микроорганизмы, способные длительно существовать в организме хозяина.

Наиболее эффективно и обоснованно использование метода в урогинекологической практике – для выявления хламидиоза, уреаплазмоза, гонореи, герпеса, гарднереллеза, микоплазменной инфекции, ВПЧ-вируса папилломы человека; в пульмонологии – для дифференциальной диагностики вирусных и бактериальных пневмоний, туберкулеза; в гастроэнтерологии – для выявления геликобактериоза; в клинике инфекционных заболеваний – в качестве экспресс-метода диагностики сальмонеллеза, дифтерии, вирусных гепатитов В, С и G; в гематологии – для выявления цитомегаловирусной инфекции, онковирусов. Высокоспецифичная, чувствительная и быстрая диагностика многих тяжелых заболеваний способствует не только их эффективному лечению, но и предотвращению распространения.

В то же время экстремальная чувствительность ПЦР требует новых подходов к клинической интерпретации результатов, получаемых в лаборатории. В частности, выявление в клинических образцах сапрофитных и условно-патогенных микроорганизмов может не означать наличия патологического процесса и поэтому не может быть автоматически интерпретировано как диагноз, особенно на фоне благополучной клинической картины у пациента. По этой же причине следует с осторожностью использовать ПЦР для анализа образцов с характерным полимикробным сообществом (кал и материал, полученный из верхних дыхательных путей и гениталий).

Экстремальная чувствительность реакции ферментативной амплификации ДНК является одновременно ахиллесовой пятой технологии ПЦР. Этот парадокс известен также как проблема чувствительности ПЦР к загрязнению (контаминированию) посторонними молекулами ДНК, которые могут служить мишенью для используемого набора праймеров. Даже единичные молекулы загрязняющей ДНК могут быть многократно копированы в процессе ПЦР, приводя к образованию целевого ДНК-продукта, а следовательно, к ложноположительному результату.

Существуют разные источники ПЦР-загрязнения. Наиболее частым является контаминирование реакционной смеси ДНК-продуктами предыдущих реакций. В результате ПЦР в каждой реакционной пробирке может образовываться более миллиарда копий исходной последовательности ДНК, каждая из которых, в свою очередь, является потенциальной мишенью для последующей амплификации. В процессе анализа синтезированные фрагменты ДНК могут легко распространяться в лаборатории в виде аэрозоля (при открывании реакционных пробирок), через руки исследователей и лабораторные принадлежности, загрязняя реактивы и материалы, используемые в ПЦР, и приводя к ложноположительному результату анализа образцов, в которых исходно отсутствовала ДНК искомого возбудителя. В случае высокой концентрации микробной ДНК в исследуемом клиническом материале ПЦР-загрязнение может происходить при переносе даже небольшого количества ДНК из одного образца в другой, например, через поверхность перчаток при открывании пробирок с образцами или через приспособления, используемые для механической гомогенизации тканей.

При использовании ПЦР с универсальными праймерами (см. выше) источником загрязняющей ДНК могут служить коммерческие препараты ДНК-полимераз и других реактивов, применяемых в ПЦР. В связи с опасностью получения ложноположительных результатов в лабораториях, постоянно использующих ПЦР в диагностических целях, необходимы соблюдение строгих требований и специальные подходы, направленные на снижение риска ПЦР-загрязнения.

Одним из наиболее существенных требований, предъявляемых к диагностическим ПЦР-лабораториям, является необ­ходимость разделения лаборатории на «пред-ПЦР-помещения», где осуществляются обработка образцов и приготовление реакционных смесей, и «после-ПЦР-поме­щения», где анализируются продукты реакции. Обязательными являются также раздельное хранение реактивов и материалов, используемых на разных этапах ПЦР, максимальное использование одноразовых пластиковых материалов на этапе, предшествующем амплификации, и регулярная обработка помещений ультрафиолетовым (УФ) излучением, повреждающим загрязняющие последовательности ДНК.

Дополнительные меры, обеспечивающие защиту ПЦР от загрязнения, могут включать использование ламинарных боксов для работы с образцами и приготовления ПЦР-смесей, специальные биохимические (урацилгликозилаза) и физико-химические (УФ излучение + изопсорален) методы инактивации ПЦР-продуктов. Особенно важно для оценки достоверности данных ПЦР-анализа и отсутствия ложноположительных результатов регулярное исследование отрицательных контролей (не содержащих ДНК-мишень) параллельно с клиническими образцами.

Помимо опасности получения ложноположительных результатов существует и обратная проблема, связанная со снижением чувствительности ПЦР, следствием которого являются ложноотрицательные результаты. На практике вопрос о соотношении теоретической (то есть максимально возможной) и реальной чувствительности ПЦР не всегда решается однозначно. Чувствительность ПЦР может быть снижена вследствие многих причин, наиболее важной из которых является ингибирование реакции компонентами биологических образцов.

Ингибиторы ПЦР могут присутствовать в образцах крови (гемоглобин), мокроты, мочи, биопсийном материале. Различные вещества, например часто используемые антикоагулянты (особенно гепарин) или компоненты кровяных питательных сред, могут также подавлять реакцию амплификации ДНК. Ингибирование ПЦР обычно можно выявить путем искусственного добавления ДНК-мишени к исследуемому образцу и ее последующей амплификации. Отрицательный результат, полученный с заведомо положительным контролем, может говорить о наличии ингибиторов, для устранения которых необходимо использовать разведение образца или специальные методы подготовки проб.

Серьезную проблему представляет также выбор конкретных методов подготовки клинических образцов к исследованию с помощью ПЦР. В настоящее время не существует универсальных подходов к выделению ДНК разных видов микроорганизмов из различных источников. Быстрые методы подготовки проб, предусматривающие возможность автоматизации, иногда не позволяют достичь требуемого уровня чувствительности. С другой стороны, многоэтапные методики, позволяющие очистить и сконцентрировать микробную ДНК для ПЦР-анализа, оказываются трудоемкими и могут увеличивать риск контаминирования образцов.

Наконец, ПЦР является дорогостоящей. Для ее реализации необходимо комплексное оснащение лаборатории, включая не только термоциклер и устройство для ДНК-электрофореза, но и отдельные центрифуги, холодильники, дозаторы и другое оборудование. Затраты на ПЦР включают высокую стоимость реактивов и расходуемых материалов. Поэтому только в случае выявления и исследования труднокультивируемых возбудителей ПЦР может быть сопоставима по стоимости с традиционными микробиологическими методами.

Заключение

Уже сейчас ПЦР является незаменимым инструментом в диагностике и исследовании многих возбудителей инфекционных болезней, а количество микробиологических приложений ПЦР продолжает стремительно расти. Дальнейшее развитие и внедрение этого метода в практику клинических диагностических лабораторий может быть связано с совершенствованием и стандартизацией самой технологии, особенно этапов подготовки образцов и анализа продуктов реакции.

Кроме того, возможность использования ПЦР для решения многих практических задач в области микробиологической диагностики зависит от ответов на следующие принципиальные вопросы.

1. Как быстро микробная ДНК элиминируется из различных тканей после гибели возбудителя в результате проводимого лечения и в каких случаях ПЦР может быть использована для контроля эффективности антимикробной терапии?

2. Можно ли при помощи ПЦР дифференцировать состояния колонизации, латентной или активной инфекции и реинфекции?

3. Может ли обнаружение микробной ДНК в «стерильных» в норме биологических жидкостях (кровь, спинномозговая жидкость) служить показателем патологического процесса?

Несомненно, накопление опыта использования ПЦР и сравнение результатов ПЦР-анализа с данными других диагностических методов позволит найти ответы на эти вопросы.

Рекомендуемая литература

1. Воробьев, А.А. Основы медицинской биотехнологии / А.А. Воробьев. - М., 1990.

2. Медицинская микробиология / под ред. В.И. Покровского. - М., 1998.

3. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология / под ред. Л.Б. Борисова. – М., 2001.

4. Микробиология и иммунология / под ред. А.А. Воробьева. - М., 1999.

5. Микробиология и иммунология для студентов ВСО / под ред. А.А. Воробьева. - М., 2000.

6. Микробиология с вирусологией и иммунологией / под ред. Л.Б. Борисова, А.М.Смирновой. - М., 1994.

ТЕСТОВЫЙ КОНТРОЛЬ ПО ТЕМЕ
«ГЕНЕТИКА МИКРООРГАНИЗМОВ И ПЦР»

1. Генетическая информация у микроорганизмов заключена в следующих структурах клетки, за исключением:

1) нуклеоида;

2) плазмид;

3) ядрышек;

4) транспозонов;

5) IS - последовательностей.

2. Плазмида бактерий - это:

1) клеточный элемент, несущий генетическую информацию, функционирующий и размножающийся независимо от хромосомы хозяина;

2) участок ДНК, способный самостоятельно мигрировать из одной плазмиды в другую внутри бактерии, а также в хромосому или бактериофаг; самостоятельно не реплицируется;

3) участок ДНК, способный перемещаться в различные участки хромосомы бактерии, самостоятельно не реплицируется.

3. IS - последовательность бактерий - это:

1) клеточный элемент, несущий генетическую информацию, функционирующий и размножающийся независимо от хромосомы хозяина;

2) участок ДНК, способный самостоятельно мигрировать из одной плазмиды в другую внутри бактерии, а также в хромосому или бактериофаг; самостоятельно не реплицируется;

3) участок ДНК, способный перемещаться в различные участки хромосомы бактерии, самостоятельно не реплицируется.

4. Транспозон бактерий - это:

1) клеточный элемент, несущий генетическую информацию, функционирующий и размножающийся независимо от хромосомы хозяина;

2) участок ДНК, способный самостоятельно мигрировать из одной плазмиды в другую внутри бактерии, а также в хромосому или бактериофаг; самостоятельно не реплицируется;

3) участок ДНК, способный перемещаться в различные участки хромосомы бактерии, самостоятельно не реплицируется.

5. Перечислите функции плазмид:

а) репарационная (восстановление повреждённого клеточного генома);

б) регуляторная (компенсация метаболических дефектов);

в) кодирующая (внесение в бактерию информации о новых признаках);

г) перенос генетической информации из прокариотической в эукариотическую клетку.

1) если верно а, в;

2) если верно б, в;

3) если верно все.

6. Транспозоны обладают всеми перечисленными функциями, кроме:

1) регуляторной;

2) кодирующей;

3) мутагенной;

4) несут генетическую информацию о транспозиции (о собственном перемещении) с одного репликона на другой;

5) несут генетическую информацию о транспозиции (о собственном перемещении) в различные участки ДНК.

7. Инсертационные последовательности способны выполнять следующие функции, за исключением:

1) перемещаться с одного репликона на другой;

2) перемещаться в различные участки ДНК;

3) кодировать взаимодействие транспозонов, плазмид, фагов между собой и с хромосомой хозяина;

4) «выключать» ген, в который встроилась IS-после­довательность, или служить промотором;

5) индуцировать мутации.

8. Какие типы бактериальных плазмид существуют?

а) F;

б) R;

в) Соl;

г) Нly;

д) tox;

е) биодеградации.

1) если верно а, б, в;

2) если верно а, г, е;

3) если верно все.

9. Какой признак контролируют F-плазмиды?

1) синтез бактериоцинов;

2) синтез половых ворсинок;

3) устойчивость к лекарственным препаратам;

4) синтез гемолизинов;

5) синтез протоксинов;

6) утилизацию некоторых органических соединений.

10. Какой признак контролируют R-плазмиды?

1) синтез бактериоцинов;

2) синтез половых ворсинок;

3) устойчивость к лекарственным препаратам;

4) синтез гемолизинов;

5) синтез протоксинов;

6) утилизацию некоторых органических соединений.

11. Какой признак контролируют Соl-плазмиды?

1) синтез бактериоцинов;

2) синтез половых ворсинок;

3) устойчивость к лекарственным препаратам;

4) синтез гемолизинов;

5) синтез протоксинов;

6) утилизацию некоторых органических соединений.

12. Какой признак контролируют Нly-плазмиды?

1) синтез бактериоцинов;

2) синтез половых ворсинок;

3) устойчивость к лекарственным препаратам;

4) синтез гемолизинов;

5) синтез протоксинов;

6) утилизацию некоторых органических соединений.

13. Какой признак контролируют tox-плазмиды?

1) синтез бактериоцинов;

2) синтез половых ворсинок;

3) устойчивость к лекарственным препаратам;

4) синтез гемолизинов;

5) синтез протоксинов;

6) утилизацию некоторых органических соединений.

14. Какой признак контролируют плазмиды биодеградаций?

1) синтез бактериоцинов;

2) синтез половых ворсинок;

3) устойчивость к лекарственным препаратам;

4) синтез гемолизинов;

5) синтез протоксинов;

6) утилизацию некоторых органических соединений.

15. Бактериоцины - это:

1) синтетические препараты, используемые при химиотерапии инфекционных заболеваний;

2) антибактериальные вещества, синтезируемые бактериями, способные вызывать гибель бактерий того же вида или близких видов;

3) вирусы, способные лизировать бактерии.

16. К синтезу бактериоцинов способны:

а) энтеробактерии;

б) возбудитель чумы;

в) холерный вибрион;

г) стафилококки;

д) коринебактерии.

1) если верно а, в;

2) если верно а, б, г;

3) если верно все.

17. Мутации классифицируют по следующим признакам, кроме:

1) происхождения;

2) числа мутировавших генов;

3) фенотипических последствий;

4) фенотипических проявлений;

5) типа нуклеиновой кислоты, в которой произошла мутация.

18. По происхождению различают мутации:

а) прямые;

б) обратные;

в) спонтанные;

г) индуцированные;

д) генные;

е) хромосомные.

1) если верно а, б;

2) если верно в, г;

3) если верно д, е.

19. По числу мутировавших генов различают мутации:

а) прямые;

б) обратные;

в) спонтанные;

г) индуцированные;

д) генные;

е) хромосомные.

1) если верно а, б;

2) если верно в, г;

3) если верно д, е.

20. По фенотипическим проявлениям (потеря или восстановление признака) различают мутации:

а) прямые;

б) обратные;

в) спонтанные;

г) индуцированные;

д) генные;

е) хромосомные.

1) если верно а, б;

2) если верно в, г;

3) если верно д, е.

21. Каково биологическое значение изменчивости для микроорганизмов?

1) приспособление к условиям существования в окружающей среде и макроорганизме;

2) восстановление повреждённого генотипа;

3) способ передачи генетического материала.

22. Фенотипическими признаками, сообщаемыми плазмидами бактериальной клетке, могут быть:

а) устойчивость к АБ;

б) выработка факторов бактериоциногенности;

в) расщепление сложных органических веществ;

г) продукция факторов вирулентности.

1) если верно а, б;

2) если верно в, г;

3) если верно все.

23. Изменчивость у микроорганизмов может возникать в результате:

1) модификаций;

2) мутаций;

3) рекомбинаций;

4) всего перечисленного.

24. Рекомбинации - это:

1) включение участка хромосомы или эписомальных элементов одного микробного штамма в хромосому другого или обмен участками хромосом между ними;

2) изменения в первичной структуре ДНК микроорганизма, выражающиеся в наследственно закреплённой утрате или изменении какого-либо признака;

3) перенос генетической информации от бактерии-донора к реципиенту посредством «голых» фрагментов ДНК.

25. У бактерий возможны следующие генетические рекомбинации, кроме:

1) конъюгации;

2) модификации;

3) трансдукции;

4) трансформации.

26. Модификация - это:

1) ненаследственные изменения какого-либо признака микроорганизма, приобретаемые им в результате собственной деятельности или воздействия окружающей среды;

2) изменения в первичной структуре ДНК микроорганизма, выражающиеся в наследственно закреплённой утрате или изменении какого-либо признака;

3) перенос генетической информации от бактерии-донора к реципиенту посредством «голых» фрагментов ДНК;

4) перенос генетического материала от бактерии-донора к реципиенту посредством бактериофагов;

5) перенос генетического материала от бактерии-донора к реципиенту при их скрещивании.

27. Мутация - это:

1) ненаследственные изменения какого-либо признака микроорганизма, приобретаемые им в результате собственной деятельности или воздействия окружающей среды;

2) изменения в первичной структуре ДНК микроорганизма, выражающиеся в наследственно закреплённой утрате или изменении какого-либо признака;

3) перенос генетической информации от бактерии-донора к реципиенту посредством «голых» фрагментов ДНК;

4) перенос генетического материала от бактерии-донора к реципиенту посредством бактериофагов;

5) перенос генетического материала от бактерии-донора к реципиенту при их скрещивании.

28. Трансформация - это:

1) ненаследственные изменения какого-либо признака микроорганизма, приобретаемые им в результате собственной деятельности или воздействия окружающей среды;

2) изменения в первичной структуре ДНК микроорганизма, выражающиеся в наследственно закреплённой утрате или изменении какого-либо признака;

3) перенос генетической информации от бактерии-донора к реципиенту посредством «голых» фрагментов ДНК;

4) перенос генетического материала от бактерии-донора к реципиенту посредством бактериофагов;

5) перенос генетического материала от бактерии-донора к реципиенту при их скрещивании.

29. Трансдукция - это:

1) ненаследственные изменения какого-либо признака микроорганизма, приобретаемые им в результате собственной деятельности или воздействия окружающей среды;

2) изменения в первичной структуре ДНК микроорганизма, выражающиеся в наследственно закреплённой утрате или изменении какого-либо признака;

3) перенос генетической информации от бактерии-донора к реципиенту посредством «голых» фрагментов ДНК;

4) перенос генетического материала от бактерии-донора к реципиенту посредством бактериофагов;

5) перенос генетического материала от бактерии-донора к реципиенту при их скрещивании.

30. Конъюгация - это:

1) ненаследственные изменения какого-либо признака микроорганизма, приобретаемые им в результате собственной деятельности или воздействия окружающей среды;

2) изменения в первичной структуре ДНК микроорганизма, выражающиеся в наследственно закреплённой утрате или изменении какого-либо признака;

3) перенос генетической информации от бактерии-донора к реципиенту посредством «голых» фрагментов ДНК;

4) перенос генетического материала от бактерии-донора к реципиенту посредством бактериофагов;

5) перенос генетического материала от бактерии-донора к реципиенту при их скрещивании.

31. Постановку ПЦР производят со следующей целью:

1) обнаружение антигенов возбудителя в материале от больного;

2) обнаружение продуктов жизнедеятельности микроорганизмов в материале от больного;

3) обнаружение соответствующих антител в сыворотке больного;

4) обнаружение специфичных фрагментов ДНК или РНК возбудителя в материале от больного или в чистой культуре микроорганизма.

32. К преимуществам ПЦР не относится:

1) прямое обнаружение возбудителя;

2) высокая чувствительность реакции (выявляет 1-10 возбудителей в пробе материала);

3) возможность определения роли условно-патогенных микроорганизмов (анализ на дисбактериоз);

4) быстрое получение результата, возможность экспресс-диагностики.

33. ПЦР нецелесообразно использовать для определения:

1) трудно культивируемых микроорганизмов (хламидии, микоплазмы и др.);

2) длительно культивируемых микроорганизмов (бруцеллы, микобактерии и др.);

3) вирусов;

4) количества условно-патогенных микроорганизмов в материале.

34. Ложноположительные результаты ПЦР чаще всего обусловлены:

1) контаминированием пробы материала посторонними молекулами ДНК;

2) внесением в пробу материала праймеров;

3) использованием ламинарных боксов для работы с образцами;

4) ингибированием реакции компонентами биологических образцов.

35. К мерам, обеспечивающим защиту ПЦР от загрязнения продуктами предыдущих реакций, можно отнести все, кроме:

1) использования ламинарных боксов для работы с образцами и приготовления ПЦР-смесей;

2) специальных биохимических (урацилгликозилаза) методов инактивации ПЦР-продуктов;

3) специальных физико-химических (УФ излучение + изопсорален) методов инактивации ПЦР-продуктов;

4) исследования отрицательных контролей (не содержащих ДНК-мишень) параллельно с клиническими образцами;

5) осуществления подготовки образцов и их исследования в одном помещении.

Ответы

№ вопр.	ответ	№ вопр.	ответ	№ вопр.	ответ	№ вопр.	ответ	№ вопр.	ответ

С.В. Поспелова, М.В. Кузнецова