Теоретические основы ИФА

История развития

История развития иммуноанализа тесно связана с развитием науки иммунологии. Термин «иммунитет» происходит от латинского «immunitas», означающего «освобождение, избавление от чего-либо». Только в XIX веке благодаря широкому распространению вакцинации, создающей иммунитет к оспе, термин «иммунитет» стал постепенно входить в медицинскую литературу. В этом новом (медицинском) качестве - как «освобождение от болезни» - его впервые в 1869 г. официально закрепил французский словарь Литте.
В 1890 г. Эмиль фон Беринг (1854 - 1917) и его сотрудникКитасато открыли, что после иммунизации дифтерийным или столбнячным токсином в крови животных появляетсянечто, способное нейтрализовать или разрушить токсин и тем самым предотвратить заболевание. Вещество, которое вызывало обезвреживание токсина, получило название антитоксина, а позднее для обозначения этого нового класса веществ был введен более общий термин - антитело. А то, что вызывает образование этих антител стали называть антигеном.

В 1897 г.Крауз описал реакцию преципитации междуантигеном и антителом. В результате появилась возможность проводитьколичественное и качественное изучение антител in vitro и практически наблюдать их действие.

Большой вклад в развитие иммуноанализа внес Пауль Эрлих (1854 - 1915). Эрлих впервые ввёл в иммунологическое исследование статистический метод - метод титрования антител и антигенов. В 1897 г. он публикует статью "Измерение активности дифтерийной сыворотки и её теоретические основы". В этой статье были заложены основы для развития иммунохимии и определены пути для количественного изучения реакции антиген - антитело на последующие примерно 50 лет. В статье декларировалось, что специфичность антител и их реакции опираются на законы структурной химии. А также в ней была предложена теория образования антител.
В 1908 г. Пауль Эрлих и Илья Мечников разделили Нобелевскую премию в качестве «признания их работ по иммунитету».

В 1907 г. выходит книга «Иммунохимия», написанная Сванте Аррениусом, которая дала название новому разделу иммунологии.

В 1937г. Тизелиус совместно с Кабатом (Kabat), используя электрофорез, продемонстрировали увеличение гамма-глобулиновой фракции сыворотки крови иммунизированных животных. Чем положили начало изучению молекулярной природы антител. Основываясь на результатах их работ, Родней Портер и Джералд Эдельман внесли огромный вклад в исследование химической структуры антител. В 50-60-ых они установили, что молекула иммуноглобулина образована двумя легкими и двумя тяжелыми цепями, и то что в ней можно выделить три фрагмента: два идентичных Fab-фрагмента и один Fc-фрагмент. На основе этих данных была создана теперь уже общепризнанная модель строения IgG. Наконец в 1969 г. Эдельман и его сотрудники полностью сумели расшифровать первичную структуру одной молекулы иммуноглобулина. Это позволило установить положение антиген-связывающего участка, а также локализовать те «домены», которые обеспечивают вторичные биологические функции антител. За эти открытия в 1972 году им была присуждена Нобелевская премия.

В 1976 году Kohler and Milstein был разработан метод получения гибридом - клеточных линий, продуцирующих антитела одной специфичности (моноклональные антитела).

Начиная с 50-ых годов 20-ого века, развиваются физико-химические методы детекции реакции антиген-антитело. Их развитие позволило увеличить чувствительность иммунохимических методов в миллионы раз, а время анализа уменьшить до нескольких часов.
Новые иммунохимические методы, были основанные на применении меченых реагентов.

В конце 50-х годов Р. Йалоу и С. Берсоном (Yalow and Berson) был разработан радиоиммунологический анализ (РИА). В качестве метки ими был использован изотоп ¹²⁵I, благодаря чему удалось достигнуть высокой чувствительности анализа (на уровне пкг/мл). Разработка РИА, положила начало целой серии методов с использованием различных меченых соединений. За разработку метода его авторы в 1977 г. были удостоены Нобелевской премии. Позднее были разработаны различные варианты радиоиммуноанализа. Так, например, Майлес и Халес (Miles and Hales) в 1968 году использовали йодированные антитела в комбинации с антигеном на твёрдой фазе. В1978 году Лангон (Langone) предложил метить йодом белок А, который способен специфично связываться с Fc фрагментами антител. Таким образом, меченый белок А можно использовать как универсальный реагент. В 1979 Вейлером и Зенком(Weiler and Zenk) был предложен авторадиографический РИА, в котором они использовали мультиканальные плашки. Кроме того, в 1981 Аксельсон с коллегами(Axelson) разработали липосомный иммуноанализ, где антиген включался в меченые йодом липидные визикулы, которые затем могли быть осаждены антителами.

В середине 60-х годов в качестве высокочувствительной метки было предложено использовать молекулы ферментов. Являясь по своей природе мощными химическими катализаторами, ферменты способны эффективно осуществлять наработку легко детектируемого продукта, что делает возможным определение ферментной метки в весьма малых концентрациях (до 10-12 М и ниже). На протяжении последних двух десятилетий иммуноферментные методы анализа интенсивно развивались как в теоретическом, так и практическом плане и к настоящему времени они сформировались в самостоятельное научное направление, имеющее важное прикладное значение. Использование твердых носителей для сорбционной или ковалентной иммобилизации антител с последующим специфическим связыванием анализируемого соединения на иммуносорбенте и выявлением образовавшихся иммунокомплексов с помощью меченных ферментами компонентов положило начало методам твердофазного (гетерогенного) иммуноферментного анализа. Впервые такой анализ провели в 1971 году Энгвал и Перлман (Е. Engvall и P. Perlmann) для IgG фракции, Ван Веемен и Шурс (К Van Weemen и A. Schuurs) для эстрогенов (1971).
В 1972 г. Рубенштейн с сотр. (К. Е. Rubenstein et al., 1972) разработали новый подход, заключающийся, в проведении всего анализа без использования твердой фазы. Метод получил название гомогенного ИФА и был основан на учете различий каталитических свойств ферментной метки в свободном виде и в иммунохимическом комплексе. В дальнейшем термин «гомогенный иммуноанализ» стал применим к любой системе иммуноанализа, в которой специфическая реакция взаимодействия антигена с антителом и определение глубины ее протекания осуществляются в гомогенном растворе.
Отсутствие стадии разделения свободного и меченого анализируемого соединения привело к сокращению времени проведения анализа до нескольких минут. Внедрение гомогенного мультиканального варианта ИФА, получившего название EMIT-анализа (Энгвал, 1980), в область клинической биохимии содействовало созданию высокочувствительных методов количественного определения гормонов, наркотических и лекарственных веществ в биологических жидкостях, что дало возможность изучить их фармакокинетику и метаболизм в организме. Большим преимуществом метода EMIT-анализа является возможность использования малых объемов анализируемого образца (5-50 мкл) и отсутствие стадии его предварительной обработки.

Ещё один вариант иммуноанализа – флуоресцентный иммуноанализ (ФИА) c использование флуоресцентных меток. Впервые такой анализ провели Смит и Хеммина (Smith, 1981 and Hemmina, 1984). Наиболее удобным из гомегенных флуоресцентных методов оказался поляризационный ФИА, основанный на измерении поляризации флуоресценции. Так, после первых работ Вебера (Weber, 1952), применение поляризации и флуоресценции для изучения биологических систем стало быстро внедрятся в иммуноанализ. Впервые поляризационно-флуоресцентный иммуноанализ (ПФИА) был описан в работах Дандликера и Спесера (Dandliker and Spencer, 1973). Основан он на конкуренции определяемого антигена и антигена, меченого флуоресцентной меткой за ограниченое число центров связывания специфических антител и измерении степени поляризации флуоресценции реакционной смеси. Первым клиническим применением ПФИА было измерение гентамицина (Watson, 1976). В качестве метки использовался флуоресцеин изотиокарбонат (FITC). Кроме флуоресцентных существуют ещё био- и хемилюминисцентные методы (Velan and Haimann, 1978).

В настоящее время метод иммуноанализа продолжает развиваться. Это обусловлено тем, что с одной стороны, расширяется число объектов исследования, с другой - углубляются и совершенствуются методы самого анализа. Кроме того, идет постоянный поиск все новых и новых веществ, используемых в качестве маркеров, чему способствует развитие химии высокомолекулярных соединений, клеточной и генной инженерии.

Теоретические основы ИФА