Классификация методов ИФА

Наиболее широкое распространение среди иммунохимических методов нашел метод иммуноферментного анализа. В настоящее время разработано несколько десятков вариантов проведения ИФА, имеющих как небольшие, так и принципиальные различия. Общим признаком всех этих методов является использование в качестве метки ферментов и возможность их детектирования в растворе с помощью соответствующих субстратных систем.

При проведении любого варианта ИФА можно выделить три основные стадии:

- первой стадией в любом варианте ИФА является узнавание анализируемого соединения специфичным к нему антителом;

- на второй стадия происходит формирование связи меченого ферментом соединения со специфическим комплексом или свободными центрами связывания;

 

 

Рисунок 9.Классификация методов иммуноферментного анализа.

- на третьем в результате реакции фермента с соответствующим субстратом происходит трансформация ферментной метки в соответствующий сигнал, измеряемый различными физико-химическими методами.

Существуют различные классификации методов ифа. Наиболее часто встречающаяся в современной литературе классификации, предложенная Б.Б. Дзантиевым, А.П. Осиповым (рис 9).

Основным критерием, положенным в основу этой классификации, является способ количественной оценки иммунных комплексов – продуктов реакции антиген-антитело. Для такой оценки существует два подхода:

- определение концентрации образовавшихся комплексов антиген-антитело (тип 1);

- определение концентрации оставшихся свободными, т.е. не вступивших в реакцию, компонентов несущих метку (либо антиген, либо антитело). При этом количество образовавшихся иммунных комплексов будет определяться по разнице: общее количество (добавленных) компонентов несущих метку – количество свободных (оставшихся) компонентов несущих метку (тип 2).

а)

 

б)

Рисунок 10.Калибровочный график зависимости уровня регистрируемого сигнала от концентрации анализируемого вещества; а) дляопределения специфического иммунного комплекса анализируемого соединения; б) для определения оставшихся свободных центров специфического связывания

 

 

Первый подход подразумевает расположение ферментной метки на образовавшихся иммунных комплексах. В связи с этим количество иммунных комплексов, образующихся в результате взаимодействия антитело-антиген, будет прямо пропорционально уровню регистрируемого сигнала, таким образом, высокий регистрирующий сигнал соответствует

высокой концентрации определяемого иммунного комплекса. В этом случае калибровочный график, представляющий собой зависимость уровня регистрируемого сигнала от концентрации анализируемого вещества, будет описываться возрастающей функцией (рис. 10 а).

В случае определения оставшихся свободных центров связывания, несущих метку, калибровочная кривая будет описывать уменьшение регистрируемого сигнала. Максимальное значение оптической плотности при этом должно соответствовать нулевой концентрации компонента несущего метку, а при увеличении концентрации значение оптической плотности уменьшается (рис. 10 б).

Следующим важным критерием классификации является тип реагентов, используемых на первой стадии анализа. В соответствии с этим критерием методы ИФА делятся на:

- неконкурентные – группа методов, в которой на первой стадии анализа в растворе присутствуют только анализируемый антиген и специфические антитела;

- конкурентные – группа методов, в которой на первой стадии анализа в растворе одновременно присутствуют анализируемое соединение, его аналог, несущий ферментную метку, и центры специфического связывания. В этом случае анализируемое соединение и его аналог будут конкурировать между собой за взаимодействие с центрами специфического связывания.

Необходимым условием проведения неконкурентных методов является соблюдение соотношений компонентов реакций: для методов типа 1 – концентрация специфических центров связывания должна быть значительно выше концентрации определяемого соединения; для методов типа 2 – концентрация определяемого соединения должна быть больше или сравнима с концентрацией специфических центров связывания.

Необходимым условием проведения конкурентного метода анализа является недостаток центров специфического связывания по отношению к суммарной концентрации анализируемого соединения и его аналога.

Следующим критерием классификации методов ИФА является тип проводимых на различных стадиях реакций. В соответствии с этим критерием методы делятся на:

- гомогенные - если все реакции, проводимые в процессе анализа, проходят в растворе, т.е. в данном случае не происходит разделения исходных и образующихся компонентов реакции;

- гетерогенные – если анализ проводится в двухфазной системе, при этом разделение на фазы может происходить на любой стадии анализа.

Обязательным компонентом гетерогенных методов является разделение исходных (не прореагировавших) и образовавшихся компонентов реакции. Разделение свободного и связанного реагента несущего метку может происходить с помощью твердой фазы или путем осаждения иммунных комплексов. В качестве твердой фазы обычно используется пластиковая поверхность.

Гетерогенные методы могут быть разделены на твердофазные и гомогенно-гетерогенные в зависимости от характера проведения первой стадии. Твердофазные – если на первой стадии антиген или антитело иммобилизованы на твердой поверхности. Гомогенно-гетерогенные – если на первой стадии взаимодействие антигена и антитела происходит в растворе, и лишь затем образовавшийся иммунный комплекс иммобилизуется на твердой поверхности.

Таким образом, большое количество вариантов проведения анализа позволяет исследователю выбирать методику соответствующую поставленным задачам.

 

4.3. Схемы проведения ИФА (варианты ELISA)

Наибольшее распространение в настоящее время получил твердофазный гетерогенный иммунный анализ - ELISA (enzyme linked immunosorbent assay).

Существует три базовых варианта проведения этого метода:

1. прямой (Direct ELISA)

2. непрямой (Indirect ELISA)

3. сендвич-метод (Sandwich ELISA)

Direct ELISA – этот метод является наиболее простым вариантом проведения ИФА. Сущность проведения этого метода состоит в следующем:

- на первом этапе растворенный в буфере анализируемый антиген вносится в пластиковую лунку (твердая фаза). В качестве буфера может быть использован карбонат/бикарбонатная буферная система рН(9,6) или нейтральный фосфатный буфер (PBS). Необходимым условием является чистота буферных растворов, отсутствие в них других посторонних белков, поэтому все буферные растворы должны готовиться на деионизированной воде. Затем в течение определенного времени происходит инкубация антигена в лунках. Время и температура при этом не являются критическими параметрами, как правило, эти условия стандартизированы и указаны в стандартных протоколах определения. Стандартная температура инкубации 37°С. В процессе инкубации происходит иммобилизация антигена на твердую фазу. После инкубации проводят отмывку, чтобы удалить свободные (неиммобилизованные) молекулы антигена. Для процедуры отмывки используют нейтральный буферный раствор (например, фосфатный) (стадия 2);

- после этого к иммобилизованному на пластиковой поверхности антигену добавляются антитела, конъюгированные с ферментом (стадия 3), которые специфичны данному антигены и напрямую связываются с ним.

- после инкубации вновь проводят процедуру отмывки и вносят в лунки соответствующий ферменту субстрат. В результате происходит ферментативная реакция с появлением окрашенного соединения (5). Через определенное время после развития окраски ферментативную реакцию останавливают, добавляя ингибирующий реагент (6).

- последним этапом является количественное определение оптической плотности окрашенного раствора с помощью спектрофотометрического оборудования.

Indirect ELISA – второй базовый метод, используемый в различных вариантах ELISA. Порядок проведения этого метода представлен на рисунке .

- начальные (1 и 2) этапы этого метода соответствуют стадиям direct ELISA, т.е. на этих стадиях происходит иммобилизация антигена на твердой фазе.

Рисунок 11.Схема прямого ELISA

 

- на следующем этапе в лунки вводятся специфичные антитела, не связанные с ферментативной меткой. Антитела должны быть растворены в специальном буфере, который предотвращает неспецифическое связывание антител с компонентами твердой фазы. После инкубации и отмывки (удалении несвязавшихся антител) в лунке остаются только связавшиеся иммунные комплексы антиген-антитело (4).

- на следующем этапе в лунки добавляют антивидовые антииммуноглобулиновые антитела связанные с ферментом. Эти антитела специфически связываются не с антигеном, а с антителами специфичными к анализируемому антигену (6). Антивидовые антитела (часто называемые вторые антитела) получают против иммуноглобулинов тех видов животных, которых иммунизировали антигеном. Например, если специфические к анализируемому антигену антитела были получены иммунизацией мыши, то антивидовые антитела получат путем введения иммуноглобулинов мыши другому животному. Достоинством меченных антивидовых антител является

 

Рисунок 12.Схема непрямого ELISA

 

их универсальность, что позволяет использовать одни и те же антивидовые антитела для анализа различных антигенов.

- заключительные этапы этого метода соответствуют direct ELISA. Они также включают в себя стадии добавления субстрата, развития окраски и определение оптической плотности раствора.

Sandwich ELISA – третий базовый вариант проведенияELISA. Свое название получил из-за того, что на стадии выявления иммунного комплекса антиген оказывается как бы зажатым между молекулами иммобилизованных и меченных антител. Этот метод используют для определения антигенов имеющих два и более неперекрывающихся антигенных эпитопа. Против каждого из эпитопов получают специфические антитела.

Достоинством этого метода является то, что он не требует использования очищенных препаратов антигенов, что значительно снижает стоимость проведения анализов. Кроме того, использование сендвич-методики позволяет увеличить чувствительность.

Схема проведения ELISA в свою очередь может проходить по двум вариантам:

- прямой сэндвич ELISA (direct sandwich ELISA)

- непрямой сэндвич ELISA (indirect sandwich ELISA)

 

Прямой сэндвич ELISA

Схема прямого сэндвич ELISA, представленная на рисунке, включает в себя:

- пассивное прикрепление антител на твердую фазу (стадия 1 и 2).

- затем эти антитела (прикрепленные антитела), специфичные к одному эпитопу антигена, связывают с антигеном (во избежание неспецифического связывания с твердой фазой антиген растворен в блокирующем буфере) (стадия 3). Важно чтобы в блокирующем буфере отсутствовали любые другие антигены, способные взаимодействовать с прикрепленными антителами.

- после инкубации и отмывки иммунные комплексы (прикрепленное антитело-антиген)остаются на твердой фазе. На следующем этапе для последующей детекции иммунных комплексов в лунки добавляют антитела конъюгированные с ферментом (эти антитела специфичные к другому эпитопу антигена).

- на заключительном этапе добавляют хромогенный субстрат, и после остановки реакции измеряют оптическую плотность раствора.

Следует учитывать некоторые недостатки этого варианта. Основной лимитирующий фактор связан с использованием антител конъюгированных с ферментом. Так как эти антитела специфичны только для одного антигена, то для определения различных антигенов необходимо каждый раз создавать новые антитела конъюгированные с ферментом. Это значительно снижает универсальность и увеличивает стоимость метода.

 

Непрямой сэндвич ELISA

Схема проведения этого варианта метода ИФА представлена на рисунке

- начальные стадии этого метода схожи с прямым сэндвич ELISA и заключаются в: иммобилизации на твердой фазе антител, специфичных к одному эпитопу антигена (стадии 1 и 2); связывании этих антител с антигеном (стадия 3); инкубации и отмывки;

- на следующей стадии к иммунным комплексам добавляют антитела (специфичные к другому эпитопу антигена) не несущие ферментативной метки;

- для детектирования иммунных комплексов, как и во всех непрямых методах ИФА в лунки вносят антивидовые антииммуноглобулиновые (вторые) антитела конъюгированные с ферментом.

- на заключительном этапе добавляют хромогенный субстрат, и после остановки реакции измеряют оптическую плотность раствора.

Рисунок 13.Схема прямого сэндвич ELISA

 

Главным преимуществом этого метода является его универсальность, связанная с использованием вторых антител. Благодаря этому свойству вторых антител создано большое количество различных тест-систем, используемых для диагностики многих заболеваний.

Кроме простых базовых методик при проведении иммуноферментных анализов часто используются более сложные варианты ELISA. Как правило, в сложных вариантах ELISA используются конкурентный или ингибиторный тип реакции. В современной иностранной литературе эти варианты соответственно имеют аббревиатуру С – тест (Competition) и I – тест (Inhibition). Кроме того, выбор варианта метода зависит от того, что является определяемым компонентом антиген или антитело. Таким образом, сложные варианты ELISA могут быть следующими:

- прямой конкурентный ELISA для определения антигена (Direct C-ELISA for Antigen)

- прямой конкурентный ELISA для определения антитела (Direct C-ELISA for Antibody)

- прямой ингибиторный ELISA для определения антигена (Direct I-ELISA for Antigen)

- прямой ингибиторный ELISA для определения антитела (Direct I-ELISA for Antibody)

- непрямой конкурентный ELISA для определения антигена (Indirect C-ELISA for Antigen)

- непрямой конкурентный ELISA для определения антитела (Indirect C-ELISA for Antibody)

- непрямой ингибиторный ELISA для определения антигена (Indirect I-ELISA for Antigen)

- непрямой ингибиторный ELISA для определения антитела (Indirect I-ELISA for Antibody)

- прямой конкурентный SandwichELISA для определения антигена (Direct Sandwich C-ELISA for Antigen)

- прямой конкурентный Sandwich ELISA для определения антитела (Direct Sandwich C-ELISA for Antibody)

- прямой ингибиторный Sandwich ELISA для определения антигена (Direct Sandwich I-ELISA for Antigen)

- прямой ингибиторный Sandwich ELISA для определения антитела (Direct Sandwich I-ELISA for Antibody)

- непрямой конкурентный Sandwich ELISA для определения антигена (Indirect Sandwich C-ELISA for Antigen)

- непрямой конкурентный Sandwich ELISA для определения антитела (Indirect Sandwich C-ELISA for Antibody)

Рисунок 14.Схема непрямого сэндвич ELISA

 

- непрямой ингибиторный Sandwich ELISA для определения антигена (Indirect Sandwich I-ELISA for Antigen)

- непрямой ингибиторный Sandwich ELISA для определения антитела (Indirect Sandwich I-ELISA for Antibody)

Однако на практике не все эти варианты находят применение.

Особенностью всех сложных вариантов ELISA является предварительное титрование определяемых иммунных комплексов. Эта процедура необходима для определения оптимальных рабочих концентраций всех компонентов реакции.

 

Титрование

Большинство вариантов проведения ELISA требуют предварительного подбора оптимальных концентраций всех компонентов реакции. Для этой цели используют метод титрования. Титр – эффективная величина, характеризующая связывающую способность антител, зависящая от их концентрации и аффинности. Титр является относительной величиной зависящей от вида метода, условий его проведения ( время, температура, рН и т.д.) и концентрации антигена. Количество определяемых компонентов будет зависеть от вида метода (табл. )

Титрование, как и определение обычно проводят в 96-ти луночных планшетах. Все растворы вносят в лунки используя многоканальные пипетки (8-ми и 12-ти канальные соответственно количеству лунок в горизонтальных и вертикальных рядах).Сущность этого процесса состоит в постепенном разведении двух компонентов реакции до тех пор, пока есть возможность определить эффект (как правило, оптическую плотность) взаимодействия этих компонентов соответствующим методом. Если в методе используется более двух компонентов, то процесс титрования ведут постепенно.

На рисунке представлена схема наиболее простого варианта титрования для прямого метода ELISA.

- Первый этап этого процесса заключается в постепенном разведении антигена. Для этого во все лунки микропланшеты вносят буферный раствор (~ 50-100 мкл). Затем в лунки 1-ого ряда вносят раствор антигена и перемешивают при помощи многоканальной пипетки, аккуратно отбирая и возвращая содержимое в лунку (прием называемый пипетирование). После этого из лунок первого ряда при помощи многоканальной пипетки отбирают часть раствора антигена и переносят его в лунки 2-ого ряда и пипетируют (уровень разведения будет зависеть от объема раствора антигена взятого из лунок 1-ого ряда) (рис. 15).

Рисунок 15.Титрование. Разведение антигена

 

Далее из лунок 2-ого ряда отбирают такой же, как и в первом случае, объем раствора и перенося в лунки 3-его ряда и т.д. до 11-ого ряда. В лунки 12-ого ряда антиген не вносят, их используют в качестве контрольных лунок, которые будут содержать только антитела и субстрат. Во всех лунках объем раствора должен быть одинаковым, поэтому из лунок 11-ого ряда удаляют соответствующий объем. Планшету инкубируют для иммобилизации антигена (стандартные условия инкубации 2 часа при 37°С) и отмывают фосфатным буфером.

 

Рисунок 16.Титрование. Разведение антител

 

- Вторая стадия включает схожую процедуру разведения антител, конъюгированных с ферментной меткой. В этом случае разведение проводят в рядах с буквенными обозначениями от А до G, а лунки ряда Н будут являться контролем, содержащем только антиген и субстрат. Антитела разводят в блокирующем буфере (содержащим инертный белок и детергент для предотвращения неспецифического связывания антител).

После раскапывания всех лунок планшету инкубируют в термостатируемом шейкере от 1 до 2 часов при 37°С. Затем лунки промывают и добавляют субстрат инкубируют и определяют оптическую плтность.

В таблице представлены примерные результаты титрования и анализ полученных данных. Оптимальная концентрация антител наблюдается в рядах D и E. При этих концентрациях антител в зависимости от концентрации антигена изменение оптической плотности имеет линейный характер от нулевого до максимальных значений.

Таблица 2. Результат титрования -определение оптимальных концентраций по полученным значениям оптической плотности

A	2,1	2,2	2,1		2,1	2,1	1,9	1,7	1,5	1,3		0,6
B	2,1		1,9		1,9	1,8	1,7	1,5	1,3	0,9	0,5	0,3
C	2,1		1,9	1,9	1,8	1,7	1,7	1,5	1,2	0,9	0,5	0,3
D	1,8	1,81	1,71	1,8	1,5	1,2		0,71	0,51	0,31	0,2	0,1
E	1,8	1,8	1,7	1,5	1,3	1,1	0,9	0,7	0,5	0,3	0,2	0,1
F	1,5	1,5	1,4	1,3	1,1	0,9	0,7	0,5	0,3	0,2	0,1	0,1
G	0,7	0,7	0,7	0,6	0,6	0,5	0,3	0,2	0,1	0,1	0,1	0,1
H	0,2	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1