Оптическая микроскопия

Для детального исследования микро- и наноструктур различной природы существует много разнообразных методов. Микроскопия как средство получения увеличенного изображения зародилась еще в XV веке, когда впервые были изготовлены простые увеличительные стекла для изучения насекомых. В конце XVII века Антонио Ван Левенгук изготовил оптический микроскоп, который позволял установить существование отдельных клеток, болезнетворных микробов и бактерий. Уже в ХХ веке были разработаны методы микроскопии с помощью электронных и ионных пучков. Таким образом, микроскопия – это совокупность методов наблюдения изображений мелких структур или деталей, невидимых невооруженным глазом, путем увеличения изображения объекта с помощью того или иного инструмента. В зависимости от вида этого инструмента различают методы: оптической, электронной, сканирующей зондовой и ионной микроскопии.

Оптическая и электронная микроскопия основаны на явлении дифракции, отражении или преломлении излучения, падающего на изучаемый объект, и последующий сбор рассеянного излучения с целью получения изображения.

Сканирующая зондовая микроскопия базируется на взаимодействии сканирующего зонда с поверхностью, а ионная – предполагает увеличение изображения за счет излучения ионных пучков.

Все эти виды используются в нанотехнологиях и составляют техническую (измерительную) основу нанометрологии.

Оптический микроскоп – первый инструмент, позволивший человеку видеть объекты малых размеров (микроскоп был сконструирован Галилеем в 1610 г.). Диапазон размеров объектов, наблюдаемых в современный оптический микроскоп, использующий свойства линз и зеркал, не может быть менее 100 нм, что ограничивает физика света. Поэтому современные оптические микроскопы позволяют увеличение объекта не более чем в 2000 раз.

Обладая малой глубиной фокуса, обычный оптический микроскоп создает «оптический срез» изображения объекта, на котором четко изображаются лишь детали объекта, попавшие в фокус. Расфокусированные же части объекта изображаются размытыми.

Изначально микроскопы давали лишь двухмерное изображение наблюдаемого объекта. Для наблюдения трехмерных объектов был создан стереомикроскоп, который использует различные оптические пути для левого и правого окуляра. Однако такой микроскоп не решает вопрос об измерении высоты и других параметров рельефа поверхности наблюдаемого объекта, а лишь обеспечивает объемное восприятие объекта человеком.

Техника стереоанализа изображений базируется на использовании стереомикроскопа, в котором с помощью двух или более видеокамер получают изображения одного и того же объекта, снятого с различных углов зрения. Далее, с помощью математического аппарата стерео триангуляции вычисляется рельеф поверхности.

Методы стереомикроскопии в целом гораздо менее точные, нежели методы измерения высоты по фокусу и используются для визуального наблюдения объемного объекта. Кроме того, существуют области на изображении, высоту которых определить нельзя из-за отсутствия текстуры.

Более совершенной является конфокальная микроскопия, самый распространенный на сегодняшний день метод реконструкции трехмерного рельефа поверхности объектов размером выше 100 нм.

Конфокальный микроскоп отличается от «классического» оптического микроскопа тем, что в каждый момент времени регистрируется изображение одной точки объекта, а полноценное изображение строится путем сканирования (движения образца или перестройки оптической системы).

Способ конфокального сканирования трехмерных микрообъектов был предложен еще в 50-х годах прошлого столетия, но первые 3D-микроскопы появились только к концу 80-х. В настоящее время на большее распространение получила лазерная сканирующая конфокальная микроскопия (LSCM – Laser Scanning Confocal Microscopy).

Таким образом, сегодня можно выделить две конкурирующие методики измерения рельефа поверхности нанообъектов. Это методы конфокальной микроскопии и методы определения высоты по фокусу, использующие «классический микроскоп». Обладая рядом преимуществ (точность, универсальность), конфокальная микроскопия все же пока является одним из самых дорогостоящих методов измерения. Методика же измерения высоты по фокусу не требует практически никакого аппаратного усовершенствования и может работать на любом оптическом микроскопе.

Световая микроскопия, как и электронная, существенно расширила области своего применения при использовании микроскопов с поэлементным принципом построения изображений. Информативные возможности растровых микроскопов, специфика формирования контраста изображений позволяют превратить их в приборы для измерений локальных параметров микрообъектов. Для этой цели особенно эффективны растровые оптические микроскопы (РОМ) с лазерными источниками излучения.