ПРАКТИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ РЕАКЦИЙ ИММУНИТЕТА

Реакции иммунитета - это реакции между антигеном и антителом или между антигеном и сенсибилизированными лимфоцитами, которые происходят в живом организме и могут быть воспроизведены invitro. В силу высокой чувствительности и строгой специфичности они нашли широкое применение при диагностике инфекционных болезней.

Реакции антигена с антителом называются серологическими (от лат. serum- сыворотка) или гуморальными (от лат. humor - жидкость). Реакции антигена с сенсибилизированными лимфоци­тами называются клеточными.

Серологические реакции - реакции взаимодействия антигена с антителом протекают в две фазы: первая фаза - специфическая, характеризуется соединением детерминантной группы антигена с активным центром антитела (видимого изменения в этой фазе не происходит; вторая фаза - неспецифическая. В этой фазе образовавшийся комплекс антиген - антитело утрачивает растворимость в изотоническом растворе и выпадает в осадок, а может быть видимым визуально. При взаимодействии антител с низкодисперсными антигенами (бактерии, эритроциты) наблюдается феномен агглютинации; при взаимодействии антител с высокодисперсными антигенами (полисахаридами, белками и их комплексами) образуются преципитаты (флокуляты).

РЕАКЦИЯ АГГЛЮТИНАЦИИ

В реакции агглютинации (РА) участвуют антитела (агглютинины), содержащиеся в сыворотке крови больного организма, антиген (агглютиноген) - клетки живых или убитых бактерий, возбудителей данной болезни, а неспецифическая фаза осуществляется в присутствии электролита (0,85 %-ного раствора хлорида натрия). Сущность реакции заключается во взаимодействии антитела с антигеном, в результате чего происходит вклеивание микробов с образованием хлопьев, комков, видимых невооруженных глазом. РА характеризуется высокой специфичностью и используется с 1 двоякой целью: а) для диагностики инфекционной болезни путем обнаружения в сыворотке крови больного животного антител к определенному – известному виду микроба (антигену); б) определения вида (типа) выпиленного микроба при помощи заведомо известных агглютинирующих сывороток, содержащих видо- и типоспецифические антитела (агглютинины).

Существует несколько методов постановки РА: пробирочный (объемный), капельный (пластинчатый), кровекапельный, кольцевая реакция с молоком, антиглобулиновый тест (реакция) Кумбса, реакция гемагглютинации и др. В ветеринарной практике РА применяется для диагностики бруцеллеза, сальмонеллеза, колибактериоза, лептоспироза, листериоза и многих других болезней, а также для идентификации выделенных возбудителей.

В последние годы широко применяют реакцию непрямой (пассивной) гемагглютинации (РНГА). По своей высокой чувствительности и специфичности РНГА заняла одно из ведущих мест в серодиагностике. Сущность ее заключается в том, что белковые молекулы антигена соответствующего возбудителя предварительно адсорбируют на обработанных танином эритроцитах барана. Затем ставят реакцию путем смешения сенсибилизированных эритроцитов с сывороткой крови больных животных. При наличии в сыворотке специфических антител на данный антиген происходит агглютинация эритроцитов - реакция положительна. РНГА ставят при диагностике микоплазмоза, сальмонеллезов, вирусных инфекций.

РЕАКЦИЯ КУМБСА

Реакция Кумбса (РК, антиглобулиновый метод) позволяет выявить неполные антитела (агглютиноиды, блокирующие). Неполные антитела одновалентны, в связи с чем они тормозят образование агглютината в РА. Кумбс (1945) предложил эффективный метод выявления неполных антител. Метод основан на применении алтиглобулиновой сыворотки, служащей посредником для соединения неполных антител, фиксированных на корпускулярных антигенах (эритроциты, бактерии). Антиглобулиновую сыворотку получают иммунизацией кроликов сывороткой крови или глобулиновой фракцией животного того вида, у которого исследуют наличие неполных антител.

Имеется два варианта постановки реакции Кумбса: прямой и непрямой. Прямой метод заключается в том, что берут эритроциты исследуемого больного (иммунизированного) животного, которые

на поверхности содержат адсорбированные неполные антитела. При добавлении антиглобулиновой сыворотки к таким эритроцитам invitro происходит их агглютинация. Непрямой вариант реакции Кумбса основан на исследовании сыворотки крови больного животного, содержащей неполные антитела. Сыворотку смешивают с эритроцитами здорового животного для адсорбции ими неполных антител. Затем к эритроцитам добавляют антиглобулиновую сыворотку, которая вступает в реакцию с неполными антителами, в результате происходит агглютинация эритроцитов.

РК используют для диагностики бруцеллеза крупного рогатого скота в бактериальном варианте, т. е. вместо эритроцитов исполь­зуют бактерии бруцелл.

РЕАКЦИЯ ПРЕЦИПИТАЦИИ

Для постановки реакции преципитации (РП) используют высокодисперсный антиген в виде прозрачного или слегка опалесцирующего раствора. При соединении антигена (преципитиногена) с антителом (преципитином) в присутствии электролита (0,85 %-ного раствора NaCl) происходит взаимодействие с образованием видимых агрегатов (помутнение, хлопья) частиц, которые постепенно осаждаются на дно пробирки. Осадок получил название «преципитат». РП протекает в две фазы. В первой происходит соединение антигена с антителом, во второй - коагуляция (преципитация) специфического комплекса антиген - антитело в растворе электролита с образованием видимых частиц (серо-белые хлопья, помутнение). Поиск антигена в исследуемом материале проводят с заведомо известной преципитирующей сывороткой.

РП высокоспецифична и чувствительна, позволяет обнаружить антиген в разведении до 1:10 млн. Применяется для исследования кожевенного сырья на сибирскую язву, идентификации некоторых вирусов, бактерий, при установлении фальсификации мяса и др.

Антиген для реакции получают путем экстракции из микробных культур, тканей и органов павших животных, а также из кожевенного сырья. Антитела получают путем гипериммунизации животных антигенами.

Существуют различные методы постановки РП. В ветеринарной практике чаще всего применяют реакцию кольцепреципитации и диффузионной преципитации в агаровом геле.

Реакция кольцепреципитации (реакция Асколи) применяется для обнаружения сибиреязвенного антигена в животном сырье (кожи, кусочки внутренних органов, мышцы). Антиген получают путем экстрагирования в физрастворе горячим или холодным способом. Полученный антиген наслаивают тонкой стеклянной пипеткой на преципитирующую сыворотку, либо сыворотку под­слаивают под антиген в узких пробирках. При положительном результате через несколько минут на границе соприкосновения антигена и антитела появляется преципитат, напоминающий серо-белое кольцо или диск.

Реакция диффузионной преципитации в геле (РДП). Эта реакция считается наиболее чувствительной и эффективной при иммунологических исследованиях. В отличие от жидкой среды, где образуется одна линия (полоска) преципитации, в условиях геля.

I реагенты (антигены и антитела) диффундируют навстречу друг другу и на границе соприкосновения (встречи) образуются белые линии преципитата. Существует несколько методов постановки РП.

Метод прямой одномерной диффузии РДП заключается в том, что на столбик или пластинку агара, содержащего специфическую преципитирующую сыворотку, наслаивают антиген в физрастворе, который медленно диффундирует в агар. В результате взаимодействия образуются полоски преципитата, соответствующие реагирующим антигену - антителу.

Метод двойной (встречной) двухмерной диффузии, предложенный Оухтерлони. Реакцию ставят в чашках Петри или на предметных стеклах, залитых 1 %-нымнейтральным агаром. В застывшем агаре с помощью пробойника вырезают по трафаретке луночки размером 0,6 мм.

Обычно в центральную лунку вносят специфическую сыворотку, в окружающие лунки испытуемые (экстракты) и контрольные антигены. Оба компонента диффундируют во встречном направлении в слое агарового геля. На месте встречи специфических антигена и антитела образуется преципитат серо-белого цвета в виде полосок, линий. При 'исследовании набора антител в исследуемых сыворотках в центральную лунку вносят известный антиген, а в окружающие - соответствующие сыворотки.

В 1953 г. Окли и Фултроп предложили сравнительно простой метод постановки РДП, заключающийся в том, что каждый реагент (антиген и антитело) смешивают с агаром отдельно и поочередно вносят в пробирку. На границе слоев в пробирке при положительном результате образуется полоска преципитата.

Радиальнаяиммунодиффузия (РИД). На поверхность стекла или пластика наливают расплавленный агар, предварительно смешанный с высокоактивной антисывороткой. В застывшем агаре делают лунку (обычно до 2 мм в диаметре) и заполняют ее точным количеством испытуемого антигена. Опыт проводят во влажной камере при постоянной температуре. Антиген диффундирует из лунок радиально в агаровый гель, смешанный с антителами, в результате образуются кольца преципитации. Диаметр этих колец прямо пропорционален концентрации антигена.

РИД используют для определения содержания растворимых антигенов, иммуноглобулинов всех классов, а также различных токсинов и ферментов.

РЕАКЦИЯ ФЛОКУЛЯЦИИ

Реакцию флокуляции открыл Рамон в 1922 г. Он установил, что при смешивании антидифтерийной сыворотки и токсина (или анатоксина) в пробирке, где произошла нейтрализация токсина, появляется помутнение, затем образуются хлопья, которые оседают на дно. Этот феномен получил название реакции флокуляции. Методика опыта заключается в следующем. В ряд пробирок с постоянной дозой токсина (например, 1 мл) вносят нарастающее количество антитоксической сыворотки. Опыт ведут при 37 °С. В отдельных пробирках через некоторое время образуется опалесценция или мелкие хлопья, постепенно выпадающие в осадок при просветлении жидкости. Смесь, в которой раньше всего появилась флокуляция, соответствует нейтральной Смеси, т. е. нейтрализации всего количества взятого токсина (инициальная флокуляция). Следовательно, если известна сила токсина, которая может быть установлена с помощью сыворотки с определенным содержанием антитоксических единиц, то можно выяснить количество антиток­сина и в неизвестной испытуемой сыворотке.

Количество анатоксина (например, столбнячного), дающее в смеси с 1 АЕ сыворотки инициальную флокуляцию, называют одной иммуногенной единицей (1 ИЕ). Сила (титр) антитоксиче­ской сыворотки характеризуется условно принятой антитоксической единицей (АЕ). АЕ противостолбнячной сыворотки считается наименьшее количество, нейтрализующее 1000 DLM столбнячного токсина.