Определение общего микробного числа.

Сущность метода заключается в определении в 1 см³ воды общего содержания мезофильных аэробов и факультативных анаэробов, способных расти на питательном агаре данного состава при температуре 37°С в течение 24 ч, образуя колонии, видимые при увеличении в 2-5 раз.

Определение общего микробного числа воды можно проводить методом серийных десятикратных разведений с посевом на мясопептонный агар (МПА) и методом прямого микроскопического подсчета микроорганизмов в исследуемой воде.

При определении первым методом производят посев проб воды на питательные среды с последующим подсчетом выросших колоний.

Объем воды для посева выбирают с таким расчетом, чтобы на чашках выросло от 30 до 300 колоний. Водопроводную воду засевают в объеме 1 мл, воду открытых водоемов – в объемах 1; 0,1 и 0,01 мл. Для посева 0,1 см³ и меньших объемов воды используют разведения анализируемой воды. Для этого в пробирку с 9 см³ стерильной воды вносят 1 см³ анализируемой воды. Другой стерильной пипеткой продуванием воздуха тщательно перемешивают содержимое пробирки, отбирают из нее 1 см³ и переносят в чашку, что будет соответствовать посеву 0,1 см³ анализируемой воды. При необходимости посева меньших объемов воды этой же пипеткой переносят 1 см³ содержимого первой пробирки в следующую с 9 см³ стерильной воды. Посев 1 см³ из второй пробирки будет соответствовать посеву 0,01 см³ анализируемой воды и т.д.

С флаконов с пробой воды снимают бумажные колпачки, вынимают пробки, горлышки фламбируют, после чего воду тщательно перемешивают осторожным продуванием воздуха через стерильную пипетку.

Засев каждого разведения проводят глубинным способом. Для этого стерильной пипеткой отбирают по 1 мл воды и вносят в 2 стерильные чашки, слегка приоткрывая крышку. После внесения воды в чашки Петри ее заливают 10-12 см³ остуженного питательного агара. Воду быстро смешивают с агаром, осторожно наклоняя или вращая чашку по поверхности стола. После этого чашки оставляют на горизонтальной поверхности до застывания среды. После застывания агара чашки с посевами помещают в термостат и выращивают при 37°С в течение 24 ч.

Воду из открытых водоемов засевают параллельно на две серии чашек, одну из которых инкубируют при температуре 37° С в течение 24 ч, а другую – при 20-22°С 48 ч. При температуре 20°С вырастает большее количество сапрофитов и именно они являются наиболее активными участниками процесса самоочищения водоема. В местах большого загрязнения сточными водами численное значение обеих групп сапрофитов близко, поэтому динамика численности этого показателя считается чувствительным индикатором загрязнения водоемов, особенно органическими веществами.

Для выявления плесневых и дрожжевых грибов исследуемую воду засевают по 0,5 мл на среду Сабуро и инкубируют при комнатной температуре в течение 3 — 4 сут. Подсчитывают число выросших колоний и также рассчитывают среднее арифметическое. Результат (ОМЧ) вычисляют путем суммирования среднего арифметического числа бактерий, дрожжевых и плесневых грибов и выражают в КОЕ/мл.

Учет результатов. Колонии, выросшие как на поверхности, так и в глубине агара, подсчитывают с помощью лупы с увеличением в 2-5 раз или прибора для счета колоний. Для этого чашку кладут вверх дном на черный фон. Для большей точности счета каждую подсчитанную колонию отмечают со стороны дна тушью или чернилами для стекла.

Оценивают только те разведения, при посеве которых на чашке выросло от 30 до 300 колоний. При посеве 1 см³ неразведенной пробы учитывают любые количества колоний, но не превышающие 300. Если в чашке с наиболее высоким разведением выросло свыше 300 колоний и анализ нельзя повторить, то допускается подсчитывать колонии с помощью пластинки с сеткой и лупы при сильном боковом освещении. Подсчитывают не менее 20 квадратов площадью 1 см² каждый в разных местах чашки, затем выводят среднее арифметическое число колоний на 1 см², значение которого умножают на площадь чашки в см², вычисленную по формуле: S = πr².

Результат подсчета колоний в каждой чашке выражают в количестве бактерий на 1 см³ анализируемой воды с учетом посеянного объема. За окончательное количество бактерий принимают среднее арифметическое результатов подсчета на двух параллельных чашках или разных разведений. Результаты округляют следующим образом: если результат находится в пределах чисел от 1 до 100, то записывают те числа, которые получены; если результат находится в пределах чисел от 101 до 1000, то результат округляют до 10; если результат находится в пределах чисел от 1001 до 10000, то результат округляют до 100 и т. д.

Количество колоний учитывают, ориентируясь на одну чашку, в случаях: если на другой чашке при посеве из разведения выросло менее 20 колоний; при ползучем росте бактерий, распространившихся на всю поверхность чашки или значительные зоны, маскирующем рост других колоний; при количестве колоний свыше 300.

Счетную пластинку рекомендуется применять при подсчете количества колоний, когда на обеих чашках отмечен ползучий рост. При этом просчитывают квадраты на свободных от сплошного роста местах чашки.

Прямой микроскопический метод определения общего количества микроорганизмов заключается в концентрации бактерий на мембранных фильтрах (при пропускании через них исследуемой воды), последующем окрашивании эритрозином и микроскопировании.

Прямой метод удобен тем, что результат, т.е. количество микроорганизмов в 1 мл воды, может быть получен в течение нескольких часов. Поэтому рекомендуется использовать прямой метод, если необходимо дать быструю санитарную оценку воды: при оценке процесса естественного самоочищения водоемов, при оценке эффективности работы очистных сооружений на всех этапах и т.д. Для фильтрования воды используют мембранные фильтры, фильтр Зейтца или специальный аппарат Долгова-Разумова.

Мембранный фильтр с окрашенными микроорганизмами высушивают и помещают на предметное стекло, предварительно капнув каплю иммерсионного масла на стекло и на фильтр, который накрывают тонким покровным стеклом. Микроскопируют с иммерсионным объективом, в окуляр вкладывают сетчатый микрометр, разделенный на мелкие квадраты. Подсчитывают микроорганизмы в 20 полях зрения (в каждом поле зрения в 4 маленьких квадратах, расположенных по диагонали). Расчет общего количества бактерий в 1 мл (X) ведется по формуле:

X = S*N*10 ⁶ / ( S₁ * V)

 где S - фильтрующая площадь прибора (мм²);

10⁶ - переводной коэффициент квадратных миллиметров в квадратные микрометры;

N - среднее количество бактерий в одном квадрате;

S₁ - площадь квадрата окулярного микрометра (мкм²);

V- объем профильтрованной воды (мл).