Определение колиформных бактерий (БГКП).

Количество колиформных бактерий выражают в виде коли-титра или коли-индекса. Коли-титр воды – минимальное количество БГКП в 1 л воды. Коли-индекс воды – количество БГКП в 1 л воды.

Для определения этих показателей используют метод мембранных фильтров и титрационный (бродильный) метод. 

Исследование воды методом мембранных фильтров. Метод основан на фильтрации установленного объема воды через мембранные фильтры, выращивании посевов на дифференциально-диагностической среде и последующей идентификации колоний по культуральным и биохимическим признакам.

Перед использованием мембранные фильтры проверяют на отсутствие трещин, отверстий, пузырей и кипятят в дистиллированной воде в течение 10 мин (при этом нельзя допускать скручивания фильтров). Для полного удаления из фильтров остатков растворителей, которые применяются при их изготовлении, кипячение следует повторить 3-5 раз со сменой дистиллированной воды. Подготовленные таким образом фильтры сохраняются в банках с дистиллированной водой или в сухом виде. В день постановки опыта фильтры повторно стерилизуют кипячением в дистиллированной воде в течение 10 мин.

Фильтрование производят с помощью специальных приборов или фильтра Зейтца. Перед посевом воды фильтровальный аппарат стерилизуют фламбированием после обтирания ватным тампоном, смоченным спиртом. После охлаждения на нижнюю часть фильтровального аппарата (столик) кладут фламбированным пинцетом стерильный мембранный фильтр, прижимают его верхней частью прибора (стаканом, воронкой) и закрепляют устройством, предусмотренным конструкцией прибора. Отросток колбы, в которую фильтруется вода, с помощью резиновой трубки соединяют с водоструйным или масляным насосом для создания вакуума в приемном сосуде (около 0,25 атм).

Объем пробы воды зависит от целей исследования. При анализе воды, поступающей в водопроводную сеть, и в наиболее характерных ее точках необходимо анализировать объем не менее 333 см³, профильтровывая этот объем не менее чем через два фильтра.

На этапах очистки анализируют не менее двух десятикратных объемов воды, выбранных в зависимости от ее качества таким образом, чтобы на одном из фильтров вырастало не более 30 колоний бактерий группы кишечных палочек. При этом необходимо ориентироваться на результаты предыдущих анализов воды в этих же пунктах (например, для воды после первичного хлорирования могут быть выбраны объемы 10 и 100 см3; для воды необеззараженной - 0,1, 1 и 10 см³). При анализе воды неизвестного качества следует засевать 3-4 десятикратных объема (например, из водопроводной сети можно фильтровать 3; 30; 100; 200 см³ воды; по этапам очистки - 0,1; 1; 10; 100 см³ воды).

Для фильтрования в воронку или стакан наливают необходимые объемы воды, начиная с меньших, а затем большие, каждый раз меняя фильтры. Самый меньший объем воды - 1 мл - следует фильтровать через фильтр, предварительно смоченный стерильной водой. После фильтрования верхнюю часть прибора снимают и фильтр осторожно (при сохранении вакуума для удаления излишка влаги на фильтре) стерильным пинцетом переносят на среду Эндо в чашку Петри. Фильтр накладывают вверх поверхностью, на которой осели бактерии, избегая появления пузырьков воздуха между фильтром и средой. На одну чашку можно разместить 4 фильтра, под каждым на дне чашки следует надписать объем воды, номер пробы и число.

Если вода мутная, то фильтрование ведется сразу через два фильтра: предварительный фильтр № 6 (для задержания крупных частиц) помещают на фильтр № 2. После фильтрования оба фильтра переносят на среду Эндо. Чашки с фильтрами помещают в термостат и инкубируют при температуре 37°С в течение 24 ч. При окончательном результате учитывают колонии, выросшие на обоих фильтрах.

При наличии в воде БГКП на фильтрах появляется рост типичных для этих бактерий колоний: темно-красные с металлическим блеском или красные, розовые с красным центром, имеющие четкий отпечаток на обратной стороне фильтра. Бактерии из таких колоний окрашивают по Граму и микроскопируют. С культурой грамотрицательных бактерий лактозополо-жительных колоний ставят оксидазный тест для дифференциации бактерий семейства Enterobacteriaceae от Pseudomonadaceae (последние являются оксидазообразующими бактериями). Для этого фильтр с выросшими на нем колониями бактерий переносят пинцетом, не переворачивая, на кружок фильтровальной бумаги, смоченной диметил-п-фенилендиамином. При наличии оксидазы реактив окрашивает колонию в синий цвет. 2-3 колонии, не изменившие окраску (оксидазоотрицательные) засевают в пробирку с полужидкой средой с 0,5% раствором глюкозы и инкубируют при 37°С. При появлении кислоты и газа результат считают положительным. Подсчитывают число красных колоний на фильтре и определяют коли-индекс.

Колииндекс (индекс ОКБ, БГКП) высчитывают следующим образом: количество бактерий группы кишечных палочек, выросших в анализируемом объеме воды, умножают на 1000 см³ и делят на этот объем воды.

К • 1000

 индекс = ---------------

 V

 где К- количество проверенных на принадлежность к ОКБ (БГКП) колоний на фильтрах;

 V- объем профильтрованной воды через фильтры, на которых велся учет.

Пример 1. При посеве трех объемов воды по 100 см³ на одном фильтре выросло три колонии бактерий группы кишечных палочек, на двух других нет роста; коли-индекс равен (3*1000):300 = 10.

Пример 2. При посеве 10 и 100 см³ воды на одном фильтре выросла одна колония, на другом выросло пять колоний; коли-индекс равен (6*1000):110 = 54.

Если на одном из фильтров сплошной рост бактерий и подсчет их невозможен, тогда в расчет принимают тот объем воды, при фильтровании которого на фильтре выросли изолированные колонии.

Для перевода индекса в титр используют формулу:

В соответствии с ГОСТ, у воды питьевой индекс ОКБ должен быть не более 3, у воды плавательного бассейна - не более 10.

Метод мембранных фильтров является современным, точным, менее трудоемким и более дешевым в сравнении с титрационным методом. Он удобен и тем, что позволяет концентрировать бактерии, содержащиеся в значительном объеме воды на небольшой поверхности фильтра. Однако одним из самых существенных недостатков метода является то, что этим методом выявляется меньшее количество бактерий в сравнении с титрационным. Для большей точности рекомендуется исследование воды проводить параллельно обоими методами.

Титрационный метод исследования воды основан на накоплении бактерий после посева установленного объема воды в жидкую питательную среду, с последующим пересевом на дифференциально-диагностическую среду и идентификации колоний по культуральным и биохимическим тестам.

Объем засеваемой воды зависит от характера исследуемого объекта, но обязательно посев ведется в 2-3, а в некоторых случаях - в 5-ти повторностях. Объемы воды выбирают с таким расчетом, чтобы в одном из разбавлений получить хотя бы один отрицательный результат. При исследовании на этапах очистки и обеззараживания засевают 100; 10; 1 и 0,1 см³ воды;  на выходе в водопроводную сеть и в наиболее характерных ее точках засевают три объема по 100 см³, три объема по 10 см³ и три объема по 1 см³.

Посев воды производится в глюкозопептонную среду (1% пептонная вода, 0,5% раствор глюкозы, 0,5% раствор хлорида натрия, индикатор Андреде, поплавок). Для посевов больших объемов воды используют концентрированную среду, содержащую 10-кратные количества указанных веществ. Так, посев 100 мл воды производят в 10 мл концентрированной среды, 50 мл - в 15 мл концентрированной среды, 10 мл - в 1 мл концентрированной среды; 1 мл и последующие разведения - в 10 мл глюкозопептонной среды нормальной концентрации. Большие объемы воды засеваются во флаконы или колбы, меньшие - в пробирки. Посевы инкубируют в термостате в течение суток при температуре 37°С.

Из пробирок с посевами, в которых наблюдается помутнение (а также образование кислоты и газа в поплавке), делают высев петлей штрихами на поверхность среды Эндо, разделенной на 3-4 сектора. Посевы выдерживают в термостате при температуре 37°С в течение 16-18 ч. При наличии на среде Эндо характерных для БГКП колоний (красных с металлическим блеском) следует провести все тесты, перечисленные выше. Положительный ответ на наличие БГКП дается в том случае, если наблюдается рост характерных колоний, образованных оксидазоотрицательными, Гр(-) бактериями, сбраживающих глюкозу при 37°С с образованием кислоты и газа. Таким образом, положительный ответ выдается через 40—42 ч.

Результат выражается в виде индекса (титра) БГКП, цифровое выражение которого определяют по таблицам: при анализе питьевой воды на выходе в водопроводную сеть и из нее – по табл. 5 и 6; при анализе воды на этапах очистки и обеззараживания – по табл. 7.

Таблица 5. Определение индекса БГКП при исследовании 300 см³ воды.

Таблица 6. Определение коли-индекса БГКП при исследовании 500 см³ воды.

Таблица 7. Определение индекса БГКП при исследовании воды по этапам очистки.