Получение моноспоровых культур

При проведении теоретических исследований или анализе популяции какой-либо географической формы, выявлении продуцентов и др. возникает необходимость получения культуры из одной споры – моноспоровую культуру. Моноспоровую культуру многих грибов получают следующими способами:

1. Готовят суспензию спор на стерильном предметном стекле в стерильной воде путем погружения обожженной петли в спорулирующую культуру. Эту суспензию спор наносят штрихом вдоль намеченной линии в чашке Петри на очень тонкую пластинку агаризованной среды, приготовленной на кипяченой воде, и выдерживают при + 24 °С. Через 15-16 часов обычно наблюдают начало прорастания и готовность спор для выделения.

При работе с бинокуляром чашку Петри перемещают вдоль линии отметки и выбирают подходящие одиночные проросшие споры. Затем вырезают агаризованную среду площадью около 2 мм² вокруг споры. Этот квадрат и зону непосредственно вокруг него проверяют при малом увеличении микроскопа, чтобы гарантировать наличие только одной споры.

Агаровый блок с проросшей спорой затем переносят при помощи стерильной иглы под бинокуляром в чашку с агаром или пробирку.

2. Питательную среду разливают тонким слоем в стерильные чашки Петри, затем берут пробирку со стерильной водой, в нее вносят небольшое количество спор исследуемого гриба и тщательно взбалтывают в воде. После этого металлической петлей берут 4-5 капель споровой суспензии и переносят на предметное стекло. Под микроскопом подсчитывают количество спор в каждой капле. Если капля заключает n спор, то в пробирку добавляют стерильную воду, чтобы объем ее увеличился в n + 1 раз.

При этом можно полагать, что в одной капле будет в среднем по одной споре. После этого из пробирки с разбавленной суспензией спор берут 3-4 капли и переносят в чашки Петри на агаризованную среду. Капли должны располагаться друг от друга на сравнительно большом расстоянии. Под микроскопом проверяют количество спор, попавшее в каждую из этих капель. Просмотр проводят с нижней стороны чашки, которую для этого осторожно переворачивают. При этом выбирают те капли, в которых содержится по одной споре и отмечают их на стекле маркером. Полученные колонии отсевают в пробирки на скошенную  агаризованную среду.

Иногда каплю суспензии, содержащую одну спору, помещают на стерильное стекло в чашку Петри и добавляют в нее кусочек агаризованной среды; после обрастания его мицелием гриба культуру переносят в пробирку или чашку Петри.

Возможно использование и других методов получения моноспоровых культур, которые указаны в специальной литературе [4, 6, 8].

Поддержание и хранение чистых культур

После выделения культур и своевременной их очистки от посторонних организмов следует поддерживать чистые культуры в жизнеспособном состоянии. Простейший способ поддержания – пересев их через определенное время в пробирки на косяки свежей агаризованной среды. Периодичность пересевов зависит от вида гриба и определяется временем его выживаемости. При пересевах переносят, главным образом, споры, а у неспорообразующих форм – мицелий из краевой зоны колонии. Следует учитывать, что длительное выращивание грибов на искусственных средах может привести к изменению свойств культуры, в частности, к потере патогенности, снижению агрессивности и вирулентности.

Для хранения выбирают лучшие из имеющихся культур. Культуры сохраняют при комнатной температуре или в холодильнике при температуре 4 °С. Пересевы (если культура хранится в холодильнике) делают реже.

При хранении в пробирках обжигают снаружи пробки и оборачивают пергаментной бумагой (фольгой, полиэтиленом и т.д.).

Периодичность пересева зависит от вида гриба. Грибы родов Cladosporium, Fusarium, Aspergillus, пересевают через 3 месяца, рода Phytophthora – каждые 3 недели.

Все культуры должны быть подписаны с указанием даты пересева. Хранить их нужно в разных местах в нескольких повторностях. Культуры необходимо периодически просматривать (во избежание попадания клещиков).

Для длительного хранения грибов лучше использовать бедные сахарами крахмальные и целлюлозные среды.

Сохранять культуры грибов можно также под минеральным маслом, в лиофилизованном состоянии (после удаления воды из замороженных суспензий под вакуумом) и в жидком азоте в ампулах.

Все культуры должны быть пронумерованы и зарегистрированы в специальных журналах, карточках, в которых записывают номер и название культуры, где и откуда она выделена, дату выделения, способ выделения, название сред, примененных при пересевах, результаты наблюдений за ростом патогена в чистой культуре и отмеченные при этом особенности.

Задание:

    1. Подготовить и простерилизовать чашки Петри и пробирки.

    2. Установить вид патогена на пораженном органе растения, используя определители.

    3. Продезинфицировать и поместить пораженные части растения во «влажную камеру».

ЗАНЯТИЕ  2