Определение жизнеспособности патогена

При определении количества жизнеспособных спор, образовавшихся на поверхности пораженных органов, а также анализе популяции патогена пользуются методом рассева определенного объема суспензии инокулюма определенного объема суспензии инокулюма на агаровой среде. Такую среду готовят из экстракта поражаемых тканей растения-хозяина.

Для приготовления суспензии на 25 мл стерильной воды берут 10 проб и 10 типично пораженных органов общей площадью в 1 см² Вырезанные кусочки пораженных тканей помещают в колбу со стерильной водой и тщательно встряхивают. Полученную суспензию сливают в чистую колбу, откуда берут по 0,1 мл для рассева на агаризованную среду, разлитую в чашки Петри. Суспензию наносят на поверхность среды стерильной пипеткой в виде капель и равномерно распределяют с помощью простерилизованного шпателя.

В качестве шпателя используют согнутую стеклянную палочку или пипетку с предварительно запаянным концом. Их стерилизуют сухим жаром и используют только один раз. Возможно и многократное использование шпателя со стерилизацией после каждого рассева в кипящей воде или над пламенем.

Перед посевом определяют количество спор, находящихся в одной капле приготовленной суспензии. Для этого при малом увеличении микроскопа подсчитывают число спор в 10 каплях и рассчитывают среднее арифметическое. Желательно, чтобы споры распределялись в суспензии равномерно и в каждой капле их количество было примерно одинаково. Если это условие не соблюдается, суспензию следует дополнительно перемешать. Среднее число спор в капле от 25 до 50 следует считать оптимальным, поскольку при высокой плотности посева создаются трудности в подсчете колоний. Уменьшение количества спор в одной капле достигается добавлением в суспензию пропорционального количества стерильной воды.

После рассева чашки Петри инкубируют при оптимальной для данного вида гриба температуре. Колонии подсчитывают как только они станут хорошо видны невооруженным глазом; наблюдения ведут на 10 чашках.

Довольно часто суспензии грибов, взятых из природного материала, оказываются сильно загрязненными эпифитной микрофлорой. Поэтому весьма затруднителен подсчет развившихся колоний на твердых питательных средах. В этом случае жизнеспособные споры учитывают по энергии их прорастания в 2-3 каплях стерильной воды с кусочками восприимчивой ткани растения-хозяина. Кусочек размером 2-3 мм в диаметре вырезают препаровальной иглой. Капли помещают во влажные камеры, приготовленные из колец Ван Тигема. Для этого необходимы простерилизованные кольца, предметные и покровные стекла. Кольца прикрепляют к предметным стеклам вазелином, которым смазывают также и их верхнюю часть; на дно кольца помещают каплю стерильной воды. Затем на нижнюю сторону покровного стекла наносят каплю суспензии, в которую кладут кусочек ткани, вырезанной из тщательно промытого в воде восприимчивого органа, питающего гриб растения. После этого стекло прижимают к кольцу. Наблюдения проводят при оптимальной температуре для прорастания спор изучаемого патогена через 6 или 9 ч после закладки опыта. Проросшими считают те споры, ростковые гифы которых превышают их длину. Преимущество этого метода заключается в том, что имеется возможность вести наблюдения под большим увеличением микроскопа.

При отсутствии колец Ван Тигема или необходимости проведения быстрого анализа жизнеспособности спор, когда их размеры позволяют проводить подсчеты при малом увеличении микроскопа, их проращивают в каплях на предметных стеклах. Последние помещают на небольших подставках во влажные камеры, приготовленные в чашках Петри по обычному способу. Точность подсчета общего числа проросших спор определяют по описанной ранее методике.

Задание:

    1. Изучить динамику роста фитопатогенных микромицетов на различных питательных средах.

Цель опыта:Выяснить влияние разных по составу питательных агаризованных сред на развитие гриба (вегетативные и генеративные функции).

Оборудование: Микроскоп, бинокуляр, пенал с набором инструментов.

Материал и условия проведения эксперимента. В качестве фитопатогенных грибов могут быть предложены следующиемикромицеты, а также источники их выделения:

– грибы из родов Phytophthora (пораженные плоды, стебли, листья томата; клубни картофеля);

– Alternaria (плоды, стебли, листья томата; листья моркови; плоды и листья капусты; листья циннии; плоды перца сладкого и др.);

– Monilia (плоды яблонь, груш, боярышника и др.);

– Cladosporium (листья томата, плоды огурца);

– Cercospora (листья свеклы, липы);

– Botrу tis (плоды томата, перца, баклажана; листья и стебли огурца; плоды малины, земляники и др.);

– Sclerotinia ( Whetzelinia) (стебли петунии, циннии, томата, огурца, перца, кабачка и др.);

– Fusarium (плоды черешни, стебли томата, колосья ржи, стебли люпина, клубни картофеля);

– Colletotrichum (стебли и листья люпина; плоды томата, дыни).

Среды: картофельно-сахарозная агаризованная среда, овсяная агаризованная среда, среда Чапека.

t = + 20 °С (в аудитории);

Повторность опыта –3- 5-ти кратная.

Методика.

Изучаемый гриб высевают в центр чашки Петри с застывшей средой по возможности немногочисленым инокулюмом всегда одной плотности и инкубируют.

Диаметр выросшей колонии измеряют линейкой в двух взаимноперпендикулярных направлениях в пяти повторностях через определенные промежутки времени (каждые 24 ч). Количество измерений зависит от скорости роста Интенсивность линейного роста колоний учитывают через 4, 6, 8 сут. Параллельно отмечают изменение окраски среды, мицелия. Описывают характер края, поверхность, цвет колонии, отмечают начало спорообразования, склероциеобразование и т.д.

Площадь колонии вычисляют по формуле: S = π × r ² .

Радиальную скорость роста колонии определяют по формуле (2); интенсивность спорообразования – с использованием камеры Горяева и формул (3) или (4).

Результаты измерений обрабатывают статистически и приводят в виде таблиц (3,4), графиков, диаграмм.

Таблица 3

Радиальная скорость роста (мм/час) фитопатогенных микромицетов на различных питательных средах

Таблица 4

Интенсивность спорообразования (штук / см² ) фитопатогенных

микромицетов на различных питательных средах

    2. Изучить влияние температуры на развитие фитопатогенных микромицетов.

Цель опыта: Выяснить влияние разных температур на рост и развитие гриба (вегетативные и генеративные функции).

Оборудование: Микроскоп, бинокуляр, пенал с набором инструментов.

Материал и условия проведения эксперимента. Среда – картофельно-сахарозная агаризованная; температурные условия:

t₁ = + 4 °С (в холодильнике); t₂ = + 10 °С (в термостате); t₃ = + 20 °С (в аудитории);

t₄ = + 35 °С (в термостате). Повторность опыта – 3-х кратная.

Методика.

Изучаемый гриб высевают в центр чашки Петри на среду по возможности немногочисленым инокулюмом всегда одной плотности и инкубируют.

Диаметр выросшей колонии измеряют линейкой в двух взаимноперпендикулярных направлениях в пяти повторностях через определенные промежутки времени (каждые 24 ч). Количество измерений зависит от скорости роста. Интенсивность линейного роста колоний учитывают через 4, 6, 8 сут. Параллельно учитывают изменение окраски среды, мицелия. Описывают характер края, поверхность, цвет колонии, отмечают начало спорообразования, склероциеобразование и т.д.

Площадь колонии вычисляют по формуле: S = π × r ² .

Радиальную скорость роста колонии определяют по формуле (2), интенсивность спорообразования – с использованием камеры Горяева и формул (3) или (4).

Результаты измерений обрабатывают статистически и приводят в виде таблиц (5,6).

Таблица 5

Влияние температуры на рост фитопатогенных микромицетов

Таблица 6

Влияние температуры на интенсивность спорообразования

фитопатогенных микромицетов

ЗАНЯТИЕ  5