Антисыворотки против определенных видов бактерий, вирусов,

Риккетсий и хламидий. В этом методе на предметном стекле с

Антигеном (мазок из исследуемой культуры, фиксированный чаще

Ацетоном) соединяется меченая антимикробная сыворотка,

выдерживается во влажной камере 30 минут при 25 ºС градусах по

Цельсию, после чего препарат 10 минут при 25 ºС промывают

Солевым буферным раствором. Образовавшийся комплекс

антиген + антитело выявляется в люминесцентном микроскопе по

Яркому свечению.

В непрямом методе Кунса сначала на предметном стекле с

Антигеном соединяется немеченая диагностическая сыворотка во

Влажной камере 30 минут, а затем с ней соединяется

Антиглобулиновая против гамма-глобулинов того вида животного, на

Котором была получена немеченая сыворотка (АГС), меченая

Флюорохромом в таких же условиях. Результат наблюдается как и

При прямом методе в люминесцентном микроскопе.

Непрямой вариант РИФ можно использовать не только для

Изучения АГ, но и для определения количества АТ в иммунной

Сыворотке.

Антикомплементарная РИФ предполагает применение

Меченых антител против комплемента морской свинки. Используется

В тех случаях, когда комплекс АГ-АТ способен фиксировать

Комплемент. Добавление к такой системе антикомплементарной

Меченой сыворотки позволяет выявлять АГ по специфическому

Свечению в люминесцентном микроскопе.

Приготовленные препараты высушивают с помощью

Фильтровальной бумаги и изучают в люминесцентном микроскопе

сначала при помощи объектива с увеличением в 40 раз (×40), а затем,

Поместив на препарат каплю нефлюоресцирующего масла, с

помощью иммерсионного объектива ×90.

Достоинством непрямой и антикомплементарной РИФ является

Использование лишь одной светящейся сыворотки (антивидовой или

Антикомплементарной) при изучении различных АГ, что значительно

Упрощает и удешевляет реакцию.

79

Иммунофлюоресцирующие сыворотки

Содержат иммуноглобулины, к которым посредством прочной

Химической связи присоединен флюорохром. При этом

Флюоресцирующие антитела сохраняют – способность

Взаимодействовать со специфическим антигеном, а флюорохром

Способность к свечению. Образовавшийся комплекс обнаруживается

В люминесцентном микроскопе.

Этапы приготовления:

– выбор животных-продуцентов;

– выбор антигена;

– гипериммунизация животных по определенной схеме;

– выделение из нативной сыворотки глобулинов;

– освобождение иммуноглобулинов от солей;

– маркирование специфических антител флюорохромом;

– стандартизация готовых сывороток.

Примеры сывороток:

– Антисыворотка для прямого Кунса – содержит

Флюоресцирующие антитела к антигенам определенного вида

Бактерий, риккетсий, вирусов, используют для сероидентификации

Выделенного возбудителя. Сейчас широко используются

Флюоресцирующие брюшнотифозные, дизентерийная, коли- и

Сибиреязвенная, чумная, холерная, туляремийная, бруцеллезная,

Риккетсиозные и некоторые вирусные антисыворотки.

– Антисыворотки для непрямого метода Кунса – АГС

(антиглобулиновые сыворотки), содержащие флюоресцирующие АТ

К диагностическим сывороткам, применяются для изучения и

Выявления бактериальных и вирусных антигенов, для обнаружения и

Титрования антител к ним, в диагностике неинфекционной патологии,

Для выявления соотношения различных классов иммуноглобулинов

При аутоиммунных заболеваниях.

– Антикомплементарная (против глобулинов морской свинки)

Меченая сыворотка – содержит флюоресциирующие антитела к

Комплементу морской свинки.

80

Меченные ферритином сыворотки для постановки

Иммунной электронной микроскопии (ИЭМ)

Ферритин – белок, содержащий до 23 % железа, хорошо

Контрастирующий и поэтому применяющийся в качестве метки.

После обработки мечеными АТ изучаемых объектов (вирусов,

Бактерий, срезов инфицированных клеток) они становятся

Электронноплотными и могут быть выявлены при электронной

Микроскопии. Чаще всего эта реакция применяется в вирусологии.

Меченые ферментом сыворотки для постановки

Иммуноферментного анализа (ИФА)

Метод основан на использовании в качестве метки АТ

Ферментов, способных разлагать субстрат и приводить к образованию

Окрашенных продуктов.

Наиболее распространенный вариант ИФА – твердофазный,

Когда антиген либо антитело фиксированы на твердом носителе,

например, в лунках планшеток из полистирола. Например, для

Выявления антигена в прямом методе ИФА на стенках лунок

Фиксируют антимикробные антитела. Если искомый антиген

Присоединяется к антителам, то он также оказывается

Фиксированным. После инкубации и отмывки связавшийся антиген

Выявляют с помощью меченых антимикробных антител.

Конъюгированные с ферментом АТ сохраняют способность

Соединяться с гомологичным АГ. Интенсивность окраски хромогена

Соответствует количеству образовавшихся комплексов АГ-АТ.

Для проведения твердофазной ИФА необходимы

полистироловые планшеты, имеющие лунки с плоским дном и

Автоматические пипетки. Для количественного учета используют