Спектрофотометр – регистратор экстинции при длине волны 492 нм.

ИФА характеризуется весьма высокой чувствительностью и

Быстротой получения результатов (в течение 4-6 часов). Каждое

Разведение ставят параллельно в двух лунках.

Наиболее распространенными ферментами-метками являются

Пероксидаза хрена и щелочная фосфатаза. Препараты из меченых

Антител называют конъюгатами. После соединения конъюгата с

Антигеном в смесь добавляют субстрат (Н2О2 или фосфатид) и

Хромоген. Субстрат расщепляется ферментом (Н2О2 пероксидазой с

81

Образованием активного кислорода, который окисляет хромоген) и

Изменяет цвет продукта реакции (например, с прозрачного до

Желтого, если хромоген ортофенилендиамин, или коричневого – если

Хромоген аминосалициловая кислота) разной степени интенсивности.

Эта интенсивность может учитываться с помощью специальных

Приборов (фотоэлектроколориметры) или визуально. Применяются

Также автоматические анализаторы (ридеры).

При определении в ИФА антител (например, серодиагностика

ВИЧ-инфекции) на носителе фиксируют известные антигены –

Непрямой метод ИФА. Затем вносится исследуемая сыворотка. Для

выявления образовавшихся комплексов антиген + антитело вносится

Антиглобулиновая сыворотка, меченая ферментом. Обязательно

Несвязанный конъюгат трижды отмывают буфером. Затем в лунку

Вносят 0,1 мл смеси раствора субстрата и хромогена и выдерживают

Минут. В процессе инкубации пероксидаза разрушает субстрат

(Н2О2) с образованием активного кислорода, который окисляет

Хромоген. В результате хромоген меняет цвет.

Конъюгаты. Содержат иммуноглобулины, в которых

Посредством прочной химической связи присоединен фермент

(пероксидаза или фосфатаза). При этом антитела сохраняют свою

Способность взаимодействовать со специфическим антигеном, а

Фермент – вступать в реакцию с субстратом и окислять хромоген. Для

Получения АТ, конъюгированных ферментом, необходимы

Высокоактивные преципитирующие сыворотки против АГ или против

Глобулинов животных или человека, из которых выделяют гамма-

Глобулиновую фракцию. Иммуноглобулины конъюгируют с

Ферментом при помощи глютаральдегида. Несвязанный фермент

Удаляют диализом или хроматографией на сефадексе. Для

Предупреждения микробной деградации в конъюгаты вносят

мертиолят до 0,01 % и хранят при 4 ºС в замороженном или

Лиофильно высушенном состоянии.

Примеры:

В настоящее время выпускают препараты пероксидазных

Конъюгатов антител для выявления антигенов стафилококков,

Пневмококков, возбудителей чумы, туберкулеза, легионеллеза, гриппа,

Парагриппа, аденовирусной инфекции и др.

82

Сыворотки, меченные радиоизотопами для постановки

Радиоиммунного анализа (РИА)

Для этого диагностического метода используются антитела,

Меченные изотопами, и учет интенсивности излучения производится

при помощи специальных счетчиков (β- или γ-излучения). Реакции

РИА очень чувствительны, позволяют обнаружить 1–2 нг и менее

Исследуемого вещества

Этапы приготовления диагностических сывороток те же, что и

Для других реакций с меткой, но маркируются антитела изотопами

I, 51Cr, 14С, 3Н.

Моноклональные антитела (МКА)

Моноклональные антитела – это особый вид иммунных

Сывороток, отличающихся высокой специфичностью. Они

Представляют собой биохимически гомогенные молекулы антител,

Обладающие паратопом (гипервариабельным участком F(ab) фрагмента

Антитела) единственной, строго определенной специфичности.

МКА против одного определенного антигенного эпитопа

Идентичны по физико-химическим свойствам, специфичности,

Аффинности и относятся к одному классу и типу иммуноглобулинов.

Моноклональные антитела точнее, чем обычные иммунные

Сыворотки, выявляют мельчайшие антигенные структуры. Их широко

Применяют в современных иммуноферментных,

Иммунофлюоресцентных и радиоиммунных методах выявления

Антигенов и антител.

В условиях макроорганизма получить моноклональные антитела

Практически невозможно. Сложность в том, что на одну и ту же

Антигенную детерминанту (эпитоп) одновременно реагируют

Множество различных клонов В-лимфоцитов, что обусловливает

Большое разнообразие продуцируемых антител.

Получить МКА удалось с помощью уникального метода

Гибридомной технологии в 1975 г. Д. Келлеру и Ц. Милштейну. Они

Осуществили гибридизацию антителопродуцирующих клеток

Животного с клетками злокачественной опухоли – В-клеточной

Плазмацитомы. Полученные клетки-гибриды, названные

гибридомами, соединили в себе свойства обоих «родителей»:

83

Способность продуцировать антитела и способность к

Неограниченному размножению.

Этапы получения гибридомных клеток:

– Иммунизация мышей нужным антигеном.

– Получение культуры В-лимфоцитов из селезенки

Иммунизированной мыши.

– Слияние иммунных B-лимфоцитов с опухолевыми клетками

В-миеломы, способными делиться бесконечно.

– Отбор жизнеспособных гибридов на селективной

Питательной среде.

Популяция отобранных гибридов способна синтезировать