Ограничения кинетики Михаэлиса-Ментен

Михаэлис и Ментен вывели уравнение с учетом двух предположений (быстро устанавливающееся равновесие и избыток субстрата). Позднее было показано, что уравнение справедливо, то есть хорошо описывает реакцию, при выполнении всех следующих условий. 7 основных постулатов для выполнения уравнения Михаэлиса-Ментен.

1. В ходе реакции образуется кинетически устойчивый фермент-субстратный комплекс.

2. Определяемая с помощью уравнения константа Кs является константой диссоциации фермент-субстратного комплекса: это справедливо, только если k₂<< k₁, k_-1.

3. Концентрация субстрата не меняется в ходе реакции, то есть [ S ] = [ S ] ₀.

4. Продукт реакции быстро отщепляется от фермента, то есть реакция двухстадийная.

5. Вторая стадия реакции необратима. Так как это практически не выполнимо, мы принимаем во внимание только начальные скорости.

6. C каждым активным центром фермента связывается только одна молекула субстрата.

7. Для всех реагирующих веществ вместо активностей можно использовать их концентрации

47 Графическии анализ результатов кинетического исследования ферментативной реакции (V₀ число "оборотов", V_mах,К_m).

V = Vmax[S]/(Km+[S]) - ур михаэлиса-ментен

Граф зав-сть для ур имеет вид: Кривая уравнения Михаэли-са-Ментен: гиперболическая зависимость начальных скоростей катализируемой ферментом реакции от концентрации субстрата.

Константа Михаэлиса измеряется в молях на литр и бывает от 10-2 до 10-7, чем меньше Кm, тем активнее фермент. При V=1/2Vmax, имеем Km = [S]. Однако, определение Vmax затруднительно по асимптоте. Для устранения этого неудобства ЛАЙНУИВЕР и БЭРК приравняли обратные зависимости левой и правой частей уравнения.

Графическое выражение для скорости реакции в координатах Лайнуивера-Бэрка имеет вид прямой линии, отсекающей на оси Х значение -1/Km, а на оси Y- значение 1/V max:

48.Физический смысл основных кинетических характеристик ферментативной реакции (Vmax, К_m).

Ур михаэлиса имеет вид: ; (V_max– максимальная скорость реакции при полном насыщении фермента субстратом) и носит несколько ограниченный характер. Поэтому были предприняты попытки усовершенствовать его. Так, было предложено уравнение Бриггса-Холдейна: где К_m представляет собой константу Михаэлиса Для определения численного значения К_m обычно находят ту концентрацию субстрата, при которой скорость ферментативной реакции v составляет половину от максимальной V_max, т.е. если v = ¹/₂ V_maх. Подставляя значение v в уравнение Бриггса–Холдейна, получаем: разделив обе части уравнения на V_mах, получим

Таким образом, константа Михаэлиса численно равна концентрации субстрата (моль/л), при которой скорость данной ферментативной реакции составляет половину от максимальной. Предельное значение, к которому стремится гипербола - Vmax данной реакции - характеризует максимальную работоспособность фермента: Vmax=k+2 x [E]. Таким образом, Vmax - это предел, к которому стремится скорость реакции при бесконечном повышении концентрации субстрата. kм - это константа Михаэлиса. Она численно равна той концентрации субстрата, при которой скорость реакции составляет половину от максимального значения. Эта кривая описывается уравнением Михаэлиса-Ментен. Физический смысл Км заключается в том, что она представляет собой константу равновесия между двумя реакциями, приводящими к распаду фермент-субстратного комплекса и той реакцией, которая ведет к образованию этого комплекса. Ks - субстратная константа. Характеризует константу равновесия 1-го этапа ферментативной реакции. Следовательно, Км обычно тоже довольно близка к Кs. Следовательно, Км, как и Кs, характеризует сродство субстрата к данному ферменту. Но экспериментально определить k-1 и k+2 очень трудно, поэтому трудно определить и Кs. А вот Км можно просто определить, используя координаты Лайнуивера-Бэрка. С помощью Км можно характеризовать сродство данного фермента к данному субстрату. Чем меньше Км, тем больше сродство фермента к данному субстрату, а значит тем больше равновесие первого этапа ферментативной реакции сдвинуто вправо - в сторону образования фермент-субстратного комплекса. Значит, будут созданы наилучшие условия для протекания и второго этапа ферментативного процесса. При таких условиях для достижения эффективного превращения субстрата требуется малая концентрация субстрата. Значит, и Vmax теоретически может быть достигнута при малых количествах субстрата. Если Км высока, то это означает, что сродство фермента к такому субстрату низкое и реакция при небольших концентрациях субстрата протекает неэффективно. Км и Vmax - это две кинетические константы, с помощью которых можно характеризовать эффективность работы фермента, в том числе и in vivo.