D. A. Dean, K. Kunsano-Kretzner, E. J. Mayer, 5 страница

Чтобы выявить сцепление, необходимо подсчитать Z-балл при разных θ дляразных семей и найти максимальное его значение. Преобразование отношения правдоподобий для каждой из семей в десятичный логарифм позволяет суммировать полученные Z(θ), Для определения сцепления локусов АВО и NPS1 было проанализировано 25 родословных, в том числе несколько с большим количеством детей, и получено значение Ζ(0,10) = +31,235 (табл. 20.2); это больше, чем +3,000, следовательно, два указанных локуса сцеплены.

Значение θ, при котором Z достигает максимума, дает грубую оценку рекомбинационного индекса для двух сцепленных локусов. В первой работе по определению сцепления локусов АВО и NPS1 точное значение Z_max не определялось, но Z-балл при θ = 0,10 был наибольшим из всех Ζ, подсчитанных для разных θ, из чего был сделан вывод, что, по-видимому, расстояние между этими двумя локусами составляет примерно 10 сМ. Необходимо подчеркнуть, что при анализе разных родословных с NPS обнаружилось, что с локусом NPS1 сцеплены разные аллели системы АВО. Другими словами, не существует специфического сцепления между конкретным аллелем системы АВО и локусом NPS1. Пока не доказано обратное, можно говорить только о генетическом сцеплении между локусами, а не между определенными аллелями. Следует также отметить, что метод подсчета лод-балла не позволяет определить аутосомную локализацию двух сцепленных локусов. Как мы увидим, для того чтобы установить, что локусы АВО и NPS1 расположены на длинном плече (q) хромосомы 9 между районами 34 и 34.2, т. е. 9q34—9q34.2, потребовались дополнительные исследования.

Построение генетических карт хромосом человека

Генетический полиморфизм

Сцепление между локусом АВО и геном наследственного онихоартроза удалось обнаружить по двум причинам. Во-первых, каждый из основных аллелей системы АВО (1^А, I^B, 1^O) можно точно идентифицировать при помощи простого лабораторного теста, так что генотипы всех исследуемых родителей и детей оказываются известными. Во-вторых, каждый аллель системы АВО встречается в популяции с высокой частотой, и вероятность того, что родители будут гетерозиготны, достаточно высока. В Великобритании, где были проведены первые работы по изучению сцепления ABO-NPS, частоты аллелей 1^А, 1^В и 1^O составляют примерно 0,66; 0,28 и 0,06 соответственно.

Термин «частота аллеля» обозначает долю конкретного аллеля среди всех аллелей данного локуса в популяции. Например, для двухаллельного локуса (A I, A2) в популяции из 13 000 человек, где 3800 человек имеют генотип А1А1, 6400 — А1А2 и2800 —А2Α2, частота аллеля A1 составляет

Таблица 20.2. Суммарные значения Z при разных θ для локусов АВО и NPSI 1)

Молекулярная генетика человека 451

а частота аллеля А2 -

Для большинства локусов частота одного аллеля (>0,999) значительно превышает частоту другого (других) (<0,001). Вследствие этого в больших популяциях подавляющее большинство (99,8%) особей оказываются гомозиготными по более часто встречающемуся аллелю, около 0,198% — гетерозиготными и 0,001% — гомозиготными по редкому аллелю. В подобных условиях практически невозможно установить сегрегацию аллелей данного локуса или его сцепление с другим локусом, поскольку большинство родителей будут гомозиготны по часто встречающемуся аллелю. Если же частоты двух аллелей данного локуса составляют 0,99 и 0,01, то гетерозиготными будут примерно 1% особей, и шансы обнаружить сегрегацию или сцепление возрастают, поскольку в популяции много особей, гетерозиготных по данному локусу (табл. 20.3). Таким образом, изучение сцепления у человека возможно только для локусов с часто встречающимися аллелями. Если два или больше аллелей данного локуса встречаются в популяции с частотой 0,01 и выше, то говорят, что имеет место генетический полиморфизм, и локус называют полиморфным. Поскольку генетический полиморфизм, подобный полиморфизму аллелей системы АВО, встречается редко, для осуществления проектов по картированию хромосом необходимо разрабатывать методы, которые позволяют с легкостью обнаруживать большое количество полиморфных сайтов.

Полиморфизм длины рестрикционных фрагментов

Для возникновения аллелей достаточно, чтобы два гомологичных гена различались всего одним нуклеотидом. Во многих случаях замена одного нуклеотида приводит к значительным различиям между продуктом измененного гена и нормальным белком. Однако множество однонуклеотидных замен не приводит к синтезу измененных генных продуктов, а кроме того, замены могут происходить в некодирующих областях ДНК и не приводить ни к каким последствиям. Такие «безвредные» замены, распределяясь по всей длине хромосомы, порождают полиморфные сайты (маркерные локусы, генетические маркеры), которые можно использовать для генетического картирования. Но сначала эти полиморфные сайты нужно обнаружить.

В 1980г. Д. Ботштейн, Р. Уайт, M Сколники В. Дэвис (D. Botstein, R.L. White, М.Н. Skolnick, R.W. Davis) разработали теоретические основы идентификации однонуклеотидных полиморфных сайтов и использования их в качестве маркеров для построения хромосомных карт человека. Смысл методологии состоит в следующем. Рестрицирующие эндонуклеазы (рестриктазы) расщепляют ДНК в специфических сайтах. Когда однонуклеотидная замена происходит внутри такого сайта, рестриктаза перестает его расщеплять, но по-прежнему узнает и расщепляет интактный сайт в другой хромосоме (рис. 20.11, А). Поскольку один из аллелей содержит сайт узнавания для данной рестриктазы, а другой — нет, то при обработке ДНК этой рестриктазой образуются фрагменты разной длины. Наличие или отсутствие полиморфного сайта рестрикции можно установить, проведя гибридизацию ДНК с зондом, строго специфичным в отношении уникального участка хромосомы.

452 ГЛАВА 20

Рис. 20.11. Использование рестрикционных сайтов в качестве генетических маркеров. А. Замена одной пары нуклеотидов в рестрикционном сайте приводит к тому, что рестриктаза не распознает его и не расщепляет ДНК. Интактный и измененный сайты рестрикции отмечены знаками (+) и (— ) соответственно. Б. Участок одной хромосомы, содержащий три сайта (А. 1 и В), узнаваемые одной и той же рестриктазой. X — расстояние между сайтами А и 1, Y — расстояние между сайтами 1 и В, X + Y -расстояние между сайтами А и В. Сайты А и В во всех случаях интактны (оба +), а сайт 1 может быть как интактным (+), так и измененным (-). Если сайт I интактен (+), то после обработки ДНК рестриктазой образуются фрагменты X и Y. Если же он изменен (— ), то образуется единственный фрагмент (X + Y). Если провести блот-гибридизацию по Саузерну с зондом α, то мы обнаружим фрагмент X в том случае, если сайт 1 интактен (+), и фрагмент (X + Y), если он изменен (— ). В. Фрагменты, образующиеся после обработки рестриктазой, и фрагменты, выявляемые при гибридизации по Саузерну с зондом а, для каждого из генотипов (+/+, +/-, — /— ). Г. Фрагменты одной хромосомы, образующиеся после обработки рестриктазой, и фрагменты, выявляемые при гибридизации с зондом β или γ.

Молекулярная генетика человека 453

Предполжим, например, что какой-то участок хромосомы содержит три сайта, распознаваемых рестриктазой HindIII (рис. 20.11, Б), при этом у всех индивидуумов сайты А и В интактны. Это означает, что в популяции нет альтернативных аллелей по этим сайтам, т. е. отсутствует полиморфизм. В отличие от этого в сайте 1 с высокой частотой встречается однонуклеотидная замена, в результате чего он становится устойчивым к расщеплению HindIII. Таким образом, две хромосомы в популяции различаются по данному сайту: одна из них расщепляется (+), а другая нет (-).

Если расстояния от сайта А до сайта 1 и от сайта ) до сайта В не совпадают, каждое из них не превышает 20 т. п, н. и существует однокопийный зонд, гибридизующийся с участком ДНК между сайтами А и 1 (рис. 20.11, Е), то после блот-гибридизации по Саузерну и разделения в агарозном геле фрагментов ДНК, полученных в результате обработки HindIII, мы сможем различить две ситуации. Первая — сайт 1 расщепляется, в результате чего образуется два фрагмента, и зонд гибридизуется с тем из них, который ограничивается сайтами А и 1. Вторая — сайт 1 не расщепляется и зонд гибридизуется с фрагментом ДНК, ограниченным сайтами А и В (рис. 20.11, Б).

Анализ реальных образцов ДНК несколько более сложен, поскольку хромосомы встречаются парами (рис. 20.11, В). Однако и в этом случае каждому генотипу (+/+, +/—, —/—) соответствует определенный набор фрагментов, образующийся в результате гибридизации с зондом. Кроме того, для выявления сайта рестрикции на участке I можно использовать зонды, гибридизующиеся с другими участками ДНК между сайтами А и В (рис. 20.11, Г). Феномен, состоящий в том, что наличие часто встречающегося в популяции измененного рестрикционного сайта приводит к образованию специфического набора фрагментов ДНК, называют полиморфизмом длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ). Полиморфные сайты рестрикции образуют маркерные локусы на той хромосоме, где они присутствуют.

Генетический статус каждого ПДРФ-локуса на одной хромосоме называют гаплотипом. В случае одного сайта существуют два возможных гаплотипа (+ или —), в случае двух разных сайтов — четыре (++, + —, —+, – –); для n локусов число гаплотипов равно 2". Определение аллелей ПДРФ-локуса (или любых других полиморфных локусов), присутствующих на хромосомах данного индивидуума, называется гаплотипированием (генотипированием, ДНК-тип ированием). Наследование ПДРФ-локусов происходит в соответствии с законами Менделя, и можно проследить их передачу в пределах родословной. Если изучается наследование двух и более ПДРФ-локусов в данной семье, то можно выявить рекомбинацию. На рис. 20.12 представлена следующая ситуация: отец (1-1) гетерозиготен по трем разным ПДРФ-локусам, расположенным на одной хромосоме, а у матери (1-2) сайты рестрикции в трех рассматриваемых локу-сах отсутствуют. Генетический статус хромосомы, унаследованной от отца каждым из детей, можно установить путем генотипирования. Сын П-2 получил от отца хромосому, в которой произошел кроссинговер; остальные дети унаследовали от него нерекомбинантные хромосомы.

На практике ДНК каждого индивидуума в отдельной пробирке обрабатывают различными

Рис. 20.12, Выявление сегрегации и рекомбинации ПДРФ-локусов в родословной. Знаками плюс (+) и минус (— ) обозначены аллели, содержащие интактные и измененные сайты рестрикции, трех ПД РФ- локусов (А, В, С), расположенных на одной хромосоме. Генетический статус I-1 определен исходя из генотипов его родителей, +++/+++ и --- / --- (не показаны). Определение гаплотипов у детей показывает, что II-2 получил от 1-1 рекомбинантнуто хромосому, а П-1 и II-3 — нерекомбинантные. Вертикальная черта, разделяющая наборы ПДРФ-аллелей под символом, обозначающим каждого члена семьи, разделяет гомологичные хромосомы.

454 ГЛАВА 20

рестриктазами, а затем гибридизуют с клонированными однокопийными фрагментами ДНК, которые используются в качестве зондов для выявления ПДРФ. Гибридизация ДНК-зонда с препаратом метафазных хромосом человека, распластанных на предметном стекле (гибридизация in situ), позволяет определить, соответствует ли данный зонд уникальному участку хромосомы (однокопийной ДНК). Для обозначения тысяч ПДРФ-локусов разработана стандартная номенклатура. Например, запись D21S18 соответствует локусу, идентифицированному с помощью ДНК-зонда (D), который гибридизуется с хромосомой 21 (21), представлен одной копией (S) и зарегистрирован Комитетом по систематизации карт сцепления человека (DNA Committee of the International System for Human Linkage Maps -ISLM) под восемнадцатым номером (18). Полиморфные маркерные сайты, расположенные внутри известных генов, обозначают по названию гена. Например, ADH — это полиморфный локус в гене алкогольдегидрогеназы (ADH1). Никакого стандартного обозначения для ПДРФ-аллелей не существует. В одних лабораториях аллели нумеруют по порядку (DlS34*l, D1S43*2 и т. д.), в других — по длине фрагмента (в т.п.н.), образующегося при наличии или в отсутствие сайта (сайтов) рестрикции (D4S56*8, D4S56*12, D4S564 и т. д.).

Уже идентифицированы тысячи ПДРФ-локусов, благодаря чему значительно увеличилось число аллелей, которые можно использовать для генетических исследований. Сцепление между ПДРФ-локусом (локуса-ми) и геном того или иного заболевания можно установить, подсчитав «парный» («двухлокусный») лод-балл для гаплотипированных семей, в которых выявлены случаи изучаемого генетического заболевания. Аналогично, сцепление между ПДРФ-локусами можно обнаружить, проанализировав данные по родословным, представленным несколькими поколениями. Использование

ПДРФ для картирования имеет несколько ограничений. Эти локусы распределены по хромосомам неравномерно, зонды в виде клонов поддерживать неудобно, а гаплотипирование большого числа индивидов из нескольких семей методом блот-гибридизации по Саузерну весьма трудоемко. К счастью, в геноме человека в большом количестве (>100 000) встречаются другие полиморфные локусы, содержащие простые повторяющиеся элементы из двух, трех или четырех пар нуклеотидов — короткие тандемные повторы (STR, от англ. short tandem repeats), которые легко регистрируются с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Полиморфизм коротких тандемных повторов

По геному человека равномерно распределены примерно 100 000 блоков динуклеотидных повторов CA/GT [(СА) · (GТ)] (рис. 20.13), содержащих от 1 до 40 повторяющихся CA/GT-элементов. Любой такой блок, локализованный в определенном участке хромосомы, передается из поколения в поколение с сохранением числа повторяющихся элементов. Для CA/GT-повтора принято обозначение (СА)_n, где n — число СА-повторов. В геноме человека встречаются и другие динуклеотидные повторы [например, (АТ)_n и т. д.], а также три-[(АТО)_n и т. д.] и тетрануклеотидные [(ATCG)_n и т. д.].

Чтобы идентифицировать полиморфные STR-локусы, нужно прежде всего провести скрининг геномной библиотеки человека, содержащей вставки небольшого размера (примерно 1000 п. н.), используя подходящий олиго-нуклеотидный зонд. Для идентификации клонированных (СА)_n-повторов обычно используют зонд, состоящий из 15 СА-элементов. Каждую позитивную вставку секвенируют, чтобы установить длину СА-повтора и нуклеотидные последовательности фланкирующих его участков. Чтобы определить, являются ли фланкирующие последовательности однокопийны-

Рис. 20. 13. Динуклеотидный тандемный повтор (СА)24, содержащий 24 повторяющихся элемента.

Молекулярная генетика человека 455

Рис. 20.14. Типирование STR-локусов, А. ДНК, полученную от разных индивидов (n = 7), амплифицировали с помощью ПЦР, используя пару праймеров (X), фланкирующих (СА)-(GТ)-повтор. Размер всех образовавшихся ПЦР-продуктов одинаков (дорожки 1—7), следовательно, одинакова и длина STR. Судя по полученным данным, STR-локус представлен только одним аллелем, Б. То же, что и на рис. А, но с использованием другой пары праймеров (Y) для другого STR-локуса. Образование двух разных ΠЦР-продуктов означает, что данный локус представлен двумя аллелями. Дорожки 1—3 соответствуют амплифииированному фрагменту ДНК индивидов, гомозиготных по одному STR-аллелю, дорожки 4 и 5 — амплифицированному фрагменту ДНК гетерозиготных индивидов, несущих два разных STR-аллеля, дорожки 6 и 7 — амплифииированному фрагменту ДНК индивидов, гомозиготных по другому STR-аллелю.

ми, проводят гибридизацию in situ с комплементарными им зондами, и если обнаруживается, что эти последовательности встречаются в геноме один раз, то синтезируют пару комплементарных им праймеров и проводят амплификацию СА-повтора. Далее, используя эту пару праймеров, проводят ПЦР-тестирование ДНК, полученной от большого числа индивидуумов. ΠЦР-продукты, длина которых для удобства электрофоретического разделения выбирается примерно 200 п. н., разделяют в полиакриламидном геле. Если длина амплифицированного таким образом сегмента ДНК одинакова для всех образцов ДНК, значит, повтор не полиморфен (рис. 20.14, А), и наоборот, если образуются

ΠЦР-продукты разной длины, это указывает на полиморфизм по данному STR (STR-полиморфизм, STRP) (рис. 20.14, Б). Различающиеся по длине СА-повторы данного локуса представляют собой аллели (рис. 20.15). Такие аллели нередко встречаются с частотой 0,20 и даже больше.

К настоящему времени уже обнаружены тысячи STRP-локусов. Для их обозначения используются те же правила, что и для ПДРФ-локусов. В то же время названия STRP-праймеров часто отличаются от названий локусов. Многие STRP-локусы были идентифицированы французскими исследователями при финансовой поддержке со стороны Французской ассоциации по мышечным дистрофиям (Association Française contre les

Рис. 20.15. Два STR-аллеля. Один из них (аллель 1) содержит повтор (CA)15 другой (аллель 2) — (СА)10. Повторы в обоих случаях фланкированы одинаковыми уникальными последовател ьностя м и .

456 ГЛАВА 20

Myopathies), и это нашло свое отражение в том, что обозначения многих пар STRP-праймеров начинаются с аббревиатуры АРМ, после которой идет идентификационный номер (AFM349xc5). Обозначение пары праймеров часто сопровождается обозначением соответствующего локуса [AFM349xc5 (D3S2017)].

В настоящее время для картирования генома человека используются в основном не ПДРФ-локусы, a STRP. В отличие от ПДРФ-зондов, которые необходимо клонировать в векторе, очищать и метить, в случае STRP-локусов нужна информация лишь о нуклеотидной последовательности пары праймеров, которая может храниться в компьютерной базе данных. Кроме того, STRP-локусы равномерно распределены в геноме человека; частоты STR-аллелей очень высоки, что обеспечивает высокую гетерозиготность, а сами аллели без труда идентифицируются после ПЦР-амплификации.

Картирование локуса генетического заболевания в определенном районе хромосомы

Анализ родословных не позволяет установить хромосомную локализацию гена того или иного заболевания, если только этот ген не находится на Х-хромосоме. Однако можно исследовать сцепление между геном данного заболевания и полиморфными ПДРФ- или STRP-локусами, идентифицируя последние с помошью соответствующих зондов. Этот подход дает наилучший результат в том случае, когда заболевание имеет четкие симптомы, его наследование носит однозначный характер и известна степень его пенетрантности.

Для анализа сцепления прежде всего берут пробы крови у членов нескольких семей, представленных двумя-тремя поколениями, либо у членов одной большой семьи, представленной несколькими поколениями, с данным генетическим заболеванием (при этом необходимо проинформировать всех испытуемых о целях анализа и получить их согласие). Клетки крови культивируют, что позволяет постоянно получать ДНК для дальнейших процедур без повторного забора крови. Проводят генотипирование ДНК каждого индивида по нескольким полиморфным маркерам. В некоторых исследованиях используют более 250 маркеров, представляющих разные участки всех аутосом. Для всех информативных семей для каждого полиморфного локуса и локуса генетического заболевания вычисляют двухточечный (двухлокусный) лод-балл. Если Z> +3,00, то имеет место сцепление, при Z< —2,00 сцепление исключается.

Для определения хромосомной локализации гена, ответственного за доброкачественные семейные судороги новорожденных (BFNC, benign familial neonatal convultions), была изучена большая семья, представленная несколькими поколениями, члены которой страдали данным заболеванием (рис. 20.16). Это состояние проявляется приступами неконтролируемых подергиваний мышц лица, туловища, рук и ног в первые шесть месяцев жизни. Примерно в 90% случаев симптомы исчезают после 1 года. По-видимому, припадки не оказывают влияния на неврологический и интеллектуальный статус. BFNC — редкое заболевание, которое имеет четкие клинические признаки, наследуется по аутосомнодоминантному типу и имеет высокую пенетрантность.

В исследованной родословной, включающей несколько поколений, два из всех протестированных полиморфных маркеров, D20SI9 и D20S20, были сцеплены с локусом BFNC (табл. 20.4; рис. 20.16). Аллели локусов D20S19 и D20S20 каждого генотипированного члена родословной, представленной на рис. 20.16, обозначены числами, расположенными одно над другим. Верхние числа соответствуют аллелям локуса D20SI9, нижние - D20S20. Вертикальная черта разделяет аллели локусов одной хромосомы.

С помощью зонда D20S19 было выявлено 10 аллелей ПДРФ-локуса, с помощью зонда D20S20 - 2 аллеля. В некоторых ПДРФ-локусах несколько сайтов узнавания для одной рестрик-тазы группируются на небольшом сегменте ДНК (примерно 20 т. п. н.) и все вместе рассматриваются как один локус. Четыре близкорасположенных сайта для одной рестриктазы могут приводить к образованию 20 фрагментов разной длины, которые выявляются одним зондом. STRP-локусы также могут иметь более двух аллелей.

Молекулярная генетика человека 457

Рис. 20.16. Анализ гаплотипов двух хромосом по 20 полиморфным локусам в родословной, члены которой больны BFNC. Числа под символами - аллели двух полиморфных локусов, D20S19 и D20S20 (верхние и нижние числа соответственно). Гаплотипы двух хромосом индивидуума разделены вертикальной чертой. Перечеркнутые символы соответствуют умершим индивидам, цветные — липам, страдающим данным заболеванием. Символ с закрашенной четвертью квадрата отвечает случаю, когда «клинический» фенотип индивида отличался от фенотипов других больных членов семьи. II-8 и II-9 - неидентичные (разнояйцевые) близнецы. Символами со звездочкой отмечены случаи возможного проявления неполной пенетрантности (III-18, IV-4, IV- 14). У больных членов семьи обнаруживается косегрегация гаплотипа (8,2) с заболеванием, все они несут эту хромосому, унаследованную от общего предка. (По данным работы Leppert et al., Nature [London] 337: 647-64S, 1989.)

Среди членов представленной на рис. 20.16 родословной в большинстве случаев наблюдается косегрегация гаплотипа (8,2) с заболеванием; это позволяет предположить, что в данной семье локус BFNC находится именно на хромосоме 8,2. Можно было ожидать, что и индивиды III-18, IV-4 и IV-14, получившие от больного родителя хромосому (8,2), также будут больны, однако это предположение не подтвердилось. Возможно, эти исключения связаны с неполной

пенетрантностью заболевания. Другими словами, у индивидов III-18, IV-4 и IV-14 есть ген BFNC, но он не экспрессируется. Аналогичные случаи при анализе сцепления других заболеваний могут обусловливаться ошибками в диагностике или тем, что у некоторых индивидов, несущих ген заболевания, симптомы еще не проявились.

В нескольких случаях дети родителя, больного BFNC, несут хромосому (8,2) (например, IV-7 и IV-11), но никаких симптомов заболевания у них не обнаруживается. В обоих упомянутых выше случаях можно определить происхождение данной хромосомы. Например, индивид IV-7 унаследовал хромосому (14,1) от больного отца, а хромосому (8,2) с нормальным геном BFNC — от здоровой матери. Сложнее объяснить генотипы индивидов IV-9 и V-1. С одной стороны, они могли получить хромосому (8,2) с нормальным геном BFNC от здоровых предков.

458 ГЛАВА 20

Построение генетической карты сцепления человека с помощью метода, основанного на полиморфизме длины рестрикционных фрагментов

D. Botstein, R. L. Whire, M. Skolnick, R. W. Davis Am. J. Hum. Genet. 32: 314-331, 1980

Часто встречающиеся типы полиморфизма у человека, которые можно типировать с помощью полимеразной цепной реакции

J. L. Weber, Р. Е, May Am. J. Hum. Genet.44; 388-396. 1989

Например, индивид IV-9 мог унаследовать хромосому (8,2) через свою мать (III-15) от бабушки (II-6). С другой стороны, отсутствие у IV-9 и V-1 признаков заболевания может объясняться неполной пенетрантностью в том случае, если они унаследовали хромосому (8,2) с геном BFNC*D от больного родителя. Необходимо подчеркнуть, что в других семьях с BFNC может не наблюдаться сцепления аллелей D20S19*S и D20S20*2 саллелем данного заболевания. Так получилось, что в рассмотренном нами случае именно эти полиморфные аллели находятся на той же хромосоме, которая несет аллель BFNC*D и которая унаследована от одного предка. В общем случае сцеплены локусы, а не аллели.