Активные формы кислорода и свободнорадикальные процессы в клетке. Биоантиокислители и антирадикальные защитные системы

Из курса химии известно, что кислород один из наиболее сильных окислителей. По способности окислять органические молекулы, он сравним с хлором, и уступает только фтору. К счастью для всего живого атомарный кислород на Земле практически не встречается, а в атмосфере присутствует только молекулярный кислород в виде двух алломорфных модификаций диоксиген и озон. Диоксиген или собственно молекулярный кислород является подавляюще преимущественной формой, которую как мы уже убедились, используют в качестве универсального окислителя все аэробные организмы. В отличие от атомарного кислорода, диоксиген в обычных условиях практически инертен по отношению к органическим соединениям и это свойство чрезвычайно важно для живой природы, поскольку позволяет эффективно управлять метаболическими процессами с помощью ферментов, и предотвращать нежелательные спонтанные процессы окисления. Именно по причине своей химической инертности молекулярный кислород не окисляет субстраты ЦТК и промежуточные компоненты электронтранспортной цепи митохондрий, а последовательно принимает электроны на ее конечном участке, восстанавливаясь до воды. Инертность диоксигена обусловлена тем, что его молекула в основном состоянии, т.е. состоянии с минимальной энергией возбуждения, является триплетной. Напротив, большинство органических соединений находится в основном синглетном состоянии. В соответствии с принципом Паули существует спиновое ограничение на протекание реакций триплетного кислорода с синглетным субстратом. т.е. принцип Паули запрещает такие реакции. Это ограничение может быть преодолено путем затрачивания высокой энергии для активации самого кислорода, что имеет место при горении или в процессах микросомального окисления, или активации субстрата окисления, как это происходит в митохондриях. В присутствии некоторых красителей-фотосенсибилизаторов при действии света триплетный кислород может перейти в возбужденное синглетное состояние (синглетный кислород), способный эффективно окислять органические молекулы. С этим процессом, называемым фотодинамический эффект, мы часто встречается в быту. Например фотодинамический эффект обуславливает выцветание органических красок на свету. В последние годы фотодинамический эффект пытаются использовать для фототерапии опухолей. С этой целью созданы противоопухолевые препараты-фотосенсибилизаторы, способные избирательно накапливаться в опухолевой ткани и продуцировать при локальном освещении опухоли синглетный кислород. Вследствие высокой химической активности синглетный кислород оказывает местное цитотоксичное действие, приводящее к деструкции опухоли. Существует еще один путь, позволяющий молекулярному кислороду преодолеть ограничения налагаемые принципом Паули. Это свободнорадикальное окисление. Оказывается, что если диоксиген взаимодействует с радикалом, т.е. молекулой или молекулярным фрагментом, имеющим неспаренный электрон, то скорость окисления органического субстрата и образование соответствующих пероксидов сравнима со скоростью окисления субстрата атомарным кислородом. В биологических системах свободные радикалы могут возникать под действием внешних факторов, например, ионизирующей радиации и ультрафиолетового излучения или процессе метаболической активации ксенобиотиков. Однако, существует не менее важный для развития болезней (патогенеза) путь образования свободных радикалов. Он обусловлен постоянно существующей возможностью "утечки" электронов с электронтранспортных систем митохондрий и микросом на кислород ведущей к образованию продукта его неполного восстановления - анион радикала кислорода или как его еще называют супероксид иона. Есть данные, что в нормальных физиологических условиях примерно от 1 до 3% поступающего в митохондрии кислорода восстанавливается только до супероксид иона. Наиболее вероятно, что утечка электронов происходит на уровне убихинона и цитохромов второго дыхательного комплекса.

NO является довольно стабильным из свободных радикалов. Превращение NO^. из физиологического регулятора в токсический агент происходит в результате взаимодействия NO. c супероксид анионом и образования ONOO^-, который, распадаясь в процессе диффузии от места его образования на ОН^- и NO₂, буквально сокрушает на своем пути самые различные биомолекулы и биомембраны.

Следует отдельно остановиться на свойствах супероксид аниона как ключевого компонента в реакции образования ONOO^-. Известно, что образование супероксида происходит при одно-электронном восстановлении молекулярного кислорода. Термин "супероксид" возник для обозначения необычной электронной конфигурации этой молекулы, но вовсе не из-за ее высокой реакционной способности. Тем не менее, до последнего времени супероксиду даже в учебниках приписывают некие «суперокисляющие» свойства. На самом же деле, при физиологических значениях рН активность супероксида довольно низка, так как для этого требуется замещение второго отрицательного заряда на его молекуле. Нейтрализация первого отрицательного заряда при протонировании облегчает действие супероксида как оксиданта [2], но и в этом случае рКа для супероксида остается равным лишь 4.8 (аналогичная величина для ONOO^- равна 6.9). Иными словами, супероксид действует как оксидант лишь в кислой среде, когда молекула-мишень является хорошим одно-электронным донором, таким как, например, восстановленное железо. Только после соединения с NO^. и образования ONOO^- супероксид (точнее, то, во что он превратился) приобретает приписываемые ему токсические свойства.

Ранее токсичность супероксида объясняли образованием из него гидроксил радикала d катализируемой железом реакции Габера-Вейса:
О₂ + Fe³⁺ ==> O₂ + Fe²⁺ (1)
Fe²⁺ + H₂O₂ ==> ^.OH + ^-OH +Fe³⁺ (2)

В этой реакции супероксид действует как восстановитель для железа. Если учесть, что концентрация супероксида в тканях колеблется от 10 до 100 пМ [7], в то время как другие восстановители, например, аскорбат, присутствуют в гораздо больших концентрациях и восстанавливют Fe³⁺ до Fe²⁺ гораздо более эффективно, то протекание такой реакции в условиях in vivo представляется маловероятным. К тому же, если супероксид действительно служит лишь в качестве источника перекиси водорода, то супероксиддисмутаза не должна была бы обладать протективными свойствами при окислительном стрессе и реперфузионных поражениях миокарда.

Супероксид способствует также увеличению пула свободного железа путем освобождения его из ферритина. Но даже при высокой концентрации железа скорость восстановления перекиси водорода до гидроксил-радикала остается очень низкой — 10³—10⁴ М^-1 сек^-1 [18].

Таким образом, реакция Габера-Вейса требует наличия компонентов, концентрация которых in vivo очень низка из-за высокой эффективности молекулярных ловушек (супероксиддисмутаза, каталаза, ферритин), что делает скорость образования гидроксил радикала зависящей от 3-х субстанций, имеющихся в наличии в очень малых концентрациях и реагирующих между собой с очень низкой скоростью

Супероксид химически несколько более активен, чем молекулярный кислород и может инактивировать некоторые ферменты, но главная его роль в патологических процессах обусловлена способностью вовлекаться в реакции приводящие к образованию других активных форм кислорода (АФК) и, в первую очередь чрезвычайно активного гидроксильного радикала. В настоящее время известно несколько таких реакций. Одна из них - реакция Фентона. Реакция Фентона включает три элементарных стадии:

1; диссмутация анион-радикала кислорода с образованием пероксида водорода O₂^.- + O₂^.- +2H⁺ → Н₂О₂ + О₂

2; собственно реакция Фентона, т.е. гомолитическое разложение пероксида водорода ионами металлов с переменной валентностью, в первую очередь двухвалентным железом с образованием гидроксильного радикала и гидроксильного аниона

H₂O₂ + Fe²⁺ →.OH + ^-OH + Fe³⁺

3; регенерация двухвалентного железа анион-радикалом кислорода

Fe³⁺ + O₂^.- → Fe²⁺ + O₂

Гидроксильный радикал и радикалы, получающиеся в результате метаболизма некоторых ксенобиотиков, например ССl₃O₂.легко отрывают атом водорода практически от любого органического субстрата. Образующийся радикал окисляется молекулярным кислородом с образованием сначала перекисного радикала, а затем гидропероксида и нового радикала субстрата и процесс, получивший название цепного свободнорадикального окисления повторяется снова.

RH + .ОН →Н₂О + R.

R.+ O₂ → ROO. (перекисный радикал)

ROO. + RH→ROOH (гидропероксид) + R.

Если радикальной атаке подвергаются ненасыщенные жирные кислоты инициируется перекисное окисление липидов, которое может привести к развитию структурно-функциональных нарушений клеточных мембран. В результате воздействия биорадикалов на ферменты происходит их окислительная модификация и потеря специфической активности. Особенно опасными последствиями для клетки и организма в целом грозит окислительное повреждение нуклеиновых кислот, так как это приводит к потере и изменению генетической информации.

Однако, как оказалось, повреждение макромолекул и субклеточных структур не только не единственное но, по-видимому, и не главное последствие образования биорадикалов в организме. По мере накопления экспериментальных фактов исследователи пришли к пониманию того, что в значительной степени действие биорадикалов на организм обусловлено их участием в процессах регуляции различных физиологических функций. Например, показано, что в регуляции процессов воспаления и пролиферации (делении клеток) участвует пероксид водорода. Роль сигнальной молекулы в процессах воспаления играет и анион-радикал кислорода. Активные формы кислорода играют важную роль в защите организмов от различной инфекции: вирусной, бактериальной и паразитарной.

Таким образом, продукция биорадикалов является необходимым условием нормального функционирования клеток и организма в целом. Чтобы поддерживать оптимальный уровень биорадикалов, предотвратить их образование в опасных для живых систем количествах и свести к минимуму негативные последствия воздействия биорадикалов на клеточные структуры в процессе эволюции у аэробных организмов сформировались специальные механизмы, обеспечивающие эффективную регуляцию свободнорадикальных процессов. Первый уровень антирадикальной защиты (физиологическая антиокислительная система) обеспечивает поддержание кислородного снабжения клеток и тканей на оптимальном для протекания биоэнергетических процессов уровне. Бактерии и простейшие имеют специальные сенсоры позволяющие оценивать уровень кислорода в среде и при его повышении быстро перемещаются в область с более низким содержанием кислорода. У всех аэробных организмов ферменты, осуществляющие процессы дыхания имеют очень высокое сродство к кислороду. Например, цитохромоксидаза млекопитающих функционирует при концентрации кислорода менее 1 мм ртутного столба. Эти особенности процессов дыхания митохондрий позволяют поддерживать в организме очень низкую внутриклеточную и внутримитохондриальную концентрацию кислорода в пределах 5-15 мм рт. ст., тогда как парциальное давление кислорода в аорте 80-100 мм рт.ст. Низкое содержание кислорода препятствует утечке электронов на кислород, напротив, повышение внутриклеточной концентрации кислорода, например, при дыхании чистым кислородом, приводит к резкому усилению образования анион-радикала кислорода в дыхательной цепи. Существуют экспериментальные данные, свидетельствующие о существовании во внутренней мембране митохондрий специальных разобщителей, способных выключать механизмы дыхательного контроля и обеспечить экстренный "сброс" кислорода при резком снижении функциональной нагрузки в клетках.

Биохимическая антиокислительная система включает специальные ферменты и низкомолекулярные антиоксиданты. Ключевым компонентом ферментной антиокислительной системы является фермент супероксиддисмутаза (СОД). Супероксиддисмутаза присутствует во всех эукариотических и прокариотических клетках за исключением облигатных (полных) анаэробов и катализирует реакцию дисмутации анион-радикала кислорода. Образующийся в результате этой реакции пероксид водорода разлагают до воды и молекулярного кислорода два других фермента каталаза и глутатионпероксидаза (Se-содержащий фермент). Глутатионпероксидаза находится в цитоплазме (70%) и в митохондриях (30%). Восстановленный глутатион (обычно обозначается GSH) – это серосодержащий трипептид, присутствует во всех клетках животных в довольно больших количествах (напр. в эритроцитах и гепатоцитах несколько миллимолей). Глутатионпероксидаза разлагает перекись водорода (и любые другие гидроперекиси) в реакции:

2GSH + H₂O₂ → GSSG+2H₂O

Глутатионредуктаза восстанавливает окисленный глутатион (GSSG). Донором восстановительных эквивалентов в этой реакции является NADPH. Отношение GSH/GSSG является важным фактором восстановительного потенциала клеток, во многом определяющим функционирование многих ферментов и сигнальных систем.

Следует отметить, что каталаза является одним из наиболее эффективных биологических катализаторов. Результат работы данного фермента (интенсивное выделение кислорода) можно видеть в случае, когда с целью дезинфекции, порез или другая рана обрабатываются раствором пероксида водорода. К низкомолекулярным антиоксидантам относятся жирорастворимые витамины Е (токоферолы) и А (каротиноиды) и водорастворимые соединения: витамин С (аскорбиновая кислота) и биофлавоноиды (т.н. витамин Р не путать с витамином РР). Витамин Е, благодаря хорошей растворимости в липидном бислое, является эффективным перехватчиком алкилперекисных и алкоксильных радикалов, образующихся в результате перекисного окисления полиненасыщенных жирнокислотных цепей фосфолипидов. Каротиноиды функционируют в качестве эффективных тушителей синглетного кислорода, образующегося в фотохимических процессах. Витамин С и биофлавоноиды обладают высокой реакционной способностью в отношении анион-радикала кислорода.

Несмотря на насыщенность аэробных клеток антиоксидантами существует опасность, что содержание биорадикалов и пероксидов в отдельных клетках и тканях в силу различных причин может многократно увеличиться и превысить детоксицирующие возможности защитной системы. В этом случае развивается окислительный стресс. Умеренный окислительный стресс может стимулировать пролиферацию клеток или напротив запустить реализацию программы гибели клетки - апоптоз.

Апоптоз (греч. опадание листьев) – особая форма запрограммированной гибели клеток. Ежедневно, примерно около 5% клеток организма подвергаются апоптозу, а их место занимают новые клетки. В процессе апоптоза клетка исчезает бесследно в течение 15-120 минут. Отличается от некроза (некроз это патологический процесс, затрагивающий одновременно большую группу клеток в результате физического или токсического воздействия, например, гипоксии) тем, что клетка не набухает и не разрывается клеточная мембрана. При этом могут поражаться отдельные клетки. Апоптоз - энергозависимый процесс, приводящий к самоубийству ослабленных, ненужных или повреждённых клеток. Размеры клеток обычно уменьшаются и наблюдается распад хроматина на фрагменты, в которых число пар оснований делится на 180-200. При электрофорезе фрагменты дают характерную картину лестницы. Эта картина отличается от таковой при некрозе клеток, где длина фрагментов ДНК варьирует. Фрагментация ДНК в нуклеосомах происходит под действием кальций чувствительной эндонуклеазы. Апоптоз не сопровождается воспалительными реакциями. Индукторы апоптоза – радиация, свободные радикалы, вирусные белки (вызывают, например, вирусный гепатит), глюкокортикоидные гормоны. Важнейшим эндогенным фактором развития апоптоза является повышение внутриклеточного уровня Са²⁺.

Сильный окислительный стресс ведет к повреждению цитоскелета и хромосомального аппарата и в итоге гибели клеток и некрозу ткани. Все болезни века: спид, рак, сердечно-сосудистые, диабет, ревматоидный артрит, а также эпилепсия, катаракты и многие другие, сопровождаются развитием окислительного стресса.