Техника выполнения работы

1. Извлечение белков. Первую навескумуки 5 г заливают 10 мл раствора хлорида калия (КСI) и интенсивно встряхивают 5 минут. Полученную суспензию переносят в центрифужную пробирку на 50 мл и добавляют 35 мл раствора КСI. Пробирку закрывают резиновой пробкой и встряхивают 15 мин. Через 15 минут осадок отделяют на центрифуге при 5000 об/мин в течение 5 минут. Экстракт сливают в мерную колбу на 100 мл через воронку с ватным фильтром, который помещают в горлышко воронки. Извлечение раствором КСI повторяют еще три раза, но с 10 мл растворителя. При тщательном извлечении в солевую вытяжку переходят не менее 30 % от общего количества азота. После добавления новой порции растворителя осадок в пробирке хорошо перемешивают палочкой. Экстракцию солевым раствором заканчивают промыванием осадка 20…30 мл дистиллированной воды, которую после перемешивания и центрифугирования сливают в мерную колбу с солевыми вытяжками и доводят до метки водой.

2. Денатурация белков при нагревании. Вторую навеску муки 5 г отвешивают в бюксе на весах и нагревают в течение 30 минут в зависимости от заданного режима (задается преподавателем) на водяной бане или электроплитке. Извлечение белков осуществляют по методике описанной выше.

3. Денатурация белка при механическом воздействии. Третью навеску муки 5 г тщательно растирают в фарфоровой ступке с 0,2 г стеклянного песка в течение 30 минут. Извлечение белков осуществляют по ранее написанной методике.

4. Количественное определение растворимых белков. Содержание водо- и солерастворимых белков определяют колориметрическим методом с биуретовым реактивом. Метод основан на определении интенсивности окраски, возникающей в результате взаимодействия белков с ионами меди в щелочном растворе. При этом раствор белка окрашивается в сине-фиолетовый цвет. Для проведения реакции 1 мл исследуемого раствора, содержащего (1…10) мг белка, смешивают с 4 мл биуретового реактива, оставляют на 30 минут при комнатной температуре в темном шкафу. По истечении времени определяют оптическую плотность при длине волны 540 нм против воды. По данной методике определяют содержание водо- и солерастворимых белков в трех ранее приготовленных навесках муки.

Расчет белка ведут по формуле:

(1.1)

где С - количество белка, найденное по калибровочному графику, мг/мл; V - объем разведения, мл; П - навеска, г; 1000-перевод мг в г.

Построение калибровочного графика. Для построения калибровочного графика 100 мг кристаллического человеческого альбумина растворяют в 10 мл физиологического раствора и делают следующие разведения:

Раствор 1. 100 мг альбумина + 10 мл 0,85% раствора поваренной соли = 10 мг белка в 1 мл.

Раствор 2. 2 мл раствора 1 + 0,7 мл физ.раствор = 7 мг белка в 1 мл.

Раствор 3. 4 мл раствора 2 + 4 мл физ.раствора = 5 мг белка в 1 мл.

Раствор 4. 5 мл раствора 3 + 5 мл физ.раствора = 2,5 мг белка в 1 мл.

Раствор 5. 5 мл раствора 4 + 5 мл физ.раствора = 1,5 мг белка в 1 мл.

Раствор 6. 5 мл раствора 5 + 5 мл физ.раствора = 0,625 мг белка в 1 мл.

Из каждого разведения берут по одному мл для проведения биуретовой реакции. Для построения калибровочного графика (средние данные, полученные из 4-х повторов) на оси ординат откладывают оптическую плотность, а на оси абсцисс – концентрацию альбумина, выраженную в мг на мл измеряемого раствора.

Расчет степени денатурации белка. Степень денатурации белков устанавливают по уменьшению растворимости по формуле:

(1.2)

где Б_д - количество растворимых белков после денатурации,%;

Б_исх - количество растворимых белков в исходной пробе до денатурации, %.

Показатели, фиксируемые в тетради:

- количество белка, найденное по калибровочному графику (C), мг/мл;

- объем разведения (V), мл; масса навески (П), г;

- количество растворимых белков после денатурации (Б_д), %;

- количество растворимых белков в исходной пробе до денатурации (Б_исх), %;

- степень денатурации белка (СД), %.

Сделать вывод о степени денатурации белков при механическом и тепловом воздействии.