Культивирование вирусов. Питательные среды, применяемые для культивирования клеточных культур. Первичные, перевиваемые и диплоидные культуры клеток

Культивирование вирусов - выращивание вирусов в искусственных условиях.

Гальтье впервые осуществил в 1879 г. культивирование вируса бешенства, заразив кролика мозгом больной собаки. Способность вируса вакцины (коровьей оспы) репродуцироваться в тканевой культуре была доказана Паркером и Наем в 1925 г. В 1931 г. Вудрафф и Э. Гудпасчер показали возможность культивирование вирусов на хорион-аллантоисной оболочке эмбрионов кур (вирус оспы птиц).

Методы культивирования:

• На лабораторных животных

• В куриных эмбрионах

• В тканевых культурах

Клеточная культура – система клеток, получаемая из ткани, находящаяся в виде слоя клеток, прикрепленных к стеклу, или в виде суспензии. Подразделяются на:

1) Первичные культуры – могут быть получены практически из любого органа (почки, легкие, кожа, тимус), однако даже при систематической смене питательной среды существуют лишь до первого пересева.

2) Стабильные (перевиваемые) линии – полностью адаптированные к существованию вне организма; их получают из нормальных и раковых тканей; размножаются неограниченно долгое время. Бывают 2 типов:

а) Нормальные клетки. В качестве стабильной культуры используют почки барана (ПКБ) и сердце обезьяны циномольгус (СОЦ);

б) Опухолевые клетки. В качестве опухолевых используют культуру клеток Hela - рак шейки матки, Hep-1 - эпидермоидный рак гортани, Дейтройт 6 - костный мозг больного раком легкого.

3) Диплоидные (эмбриональные) культуры – получаемые из эмбриональных тканей человека и животных, сохраняющие диплоидный набор хромосом до 50 пересевов.

Наиболее практическое применение получили однослойные культуры первично-трипсинизированных и перевиваемых линий клеток.

Приготовление первичных (трипсинизированные) культур клеток. Берется орган → разрушается межклеточная ткань и происходит разобщение клеток путём воздействия на ткань протеолитических ферментов (трипсина, панкреатина) для последующего получения монослоя клеток на стекле.

В питательной среде должен присутствовать необходимый набор из неорганических ионов, аминокислот и витаминов. Различают искусственные (полусинтетические и синтетические) и естественные питательные среды.

Естественные питательные среды - это биологические жидкости (сыворотка крови, эмбриональный экстракт, асцитическая жидкость, коровья амниотическая жидкость, тканевые экстракты и др.). Питательные среды из естественных компонентов применяют редко, только для выращивания вновь изолированных тканей в начале культивирования и для поддержания очень прихотливых тканей животных.

Полусинтетические питательные среды представляют собой естественные среды, подверженные первичной ферментативной обработке. К таким средам относят гемогидролизаты, гидролизат лактальбумина, аминопептид и др.

Лучшими средами для культивирования культуры клеток являются синтетические питательные среды: 199 (содержит 60 компонентов: 10 аминокислот, 17 витаминов, 8 минеральных солей, 10 компонентов, входящих в состав нуклеиновых кислот и др.), Игла, Хенкса, Эрла (эти среды имеют аминокислоты, витамины, глюкозу, минеральные соли). Смена питательной среды проводится через 2-3 дня.

В зависимости от назначения среды подразделяются на: ростовые и поддерживающие. Ростовые применяются в первой фазе культивирования клеток, когда необходимо стимулировать клетки на максимально ускоренный рост и размножение. Они богаты питательными веществами, что способствует активному размножению клеток. Поддерживающие применяют во второй фазе культивирования клеток после заражения культуры клеток вирусами. Они поддерживают жизнеспособность клеток.

О наличии вируса в зараженной культуре клеток можно судить по цитопатическому действию (ЦПД) – это патологические изменения морфологии клеток, вплоть до их гибели, возникающие в результате репродукции вирусов, и наблюдаемые под микроскопом. Проявления ЦПД:

1. Дегенерация клеток (наблюдаются округления, изменения формы, разрушения).

2. Появление включений (Липшются – вирус герпеса; Гварниери – вирус натуральной оспы) и телец Бабеша-Негри – вирус бешенства).

3. Разрушение пласта клеток (парамиксовирусы).

4. Образование гигантских многоядерных клеток - симпластов (вирус кори).

5. Образование «негативных колоний», или «бляшкообразование» – ограниченные участки разрушенных вирусами клеток (дегенеративных клеток) в сплошном монослое культуре клеток. Они видны невооруженным глазом в виде светлых пятен на фоне окрашенного монослоя живых клеток. Добавление агара в питательную среду ограничивает распространение вирусов по всему монослою после выхода их из разрушенной клетки и обеспечивает взаимодействие вирусов только с соседними клетками. Каждая «бляшка» образуется потомством одного вириона. Титр вируса выражают числом бляшкообразующих единиц (БОЕ) в 1 мл.

Основные методы индикации вирусов в культуре тканей:

а. “+” гемагглютинация. Реакция гемагглютинации – склеивание эритроцитов при добавлении вирусосодержащего материала (есть вирус – эритроциты оседают в виде “зонтика”; нет вируса – в виде “диска”).

б. “+” гемадсорбция. Реакция гемадсорбции – адсорбция эритроцитов на поверхности пораженных вирусом клеток и образуют характерные скопления (вирус гриппа вызывает агглютинацию эритроцитов островкового типа).

в. Реакция нейтрализации вирусов в культуре тканей.

г. Цветная реакция Солка - основана на изменении цвета питательной среды. В результате жизнедеятельности клетки в питательную среду выделяются продукты клеточного метаболизма и происходит сдвиг рН в кислую сторону, о чем свидетельствует изменение цвета среды из красного в желтый. Если вирус присутствует и реплицируется в культуре, то вследствие разрушающего действия вируса клетки дегенерируются (разрушаются, т.е. их нет), и подавляется их метаболизм, т.е. цвет среды неизменяется.