Вирусы теплокровных в качестве эукариотических векторов

Вирусные векторы – это современный инструмент для доставки генетического материала в клетку. При выборе вектора необходимо учитывать некоторые важные особенности жизненного цикла и биологии исходного вируса. Вирусные векторы широко используют в доклинических исследованиях и в настоящее время именно с ними проводят большинство клинических испытаний. Потенциально вирусные векторы могут применяться как один из способов доставки генов в генной терапии новообразований и наследственных заболеваний. Вирусные системы включают векторы, разработанные на основе ретровирусов, аденовирусов, лентивирусов и вирусов простого герпеса.

Ретровирусы. Это небольшие РНК-содержащие вирусы, способные заражать только делящиеся клетки, в которых они репродуцируются. Вирусный геном (в виде провируса) встраивается в ДНК клетки-мишени. Поэтому ретровирусные векторы теоретически способны обеспечить длительную экспрессию трансгенов в некоторых типах клеток. Большинство ретровирусных векторов получено на основе вируса лейкоза мышей Молони. Геном вируса изменен так, чтобы избежать экспрессии вирусных белков в зараженных клетках, что предотвращает развитие иммунного ответа против этих клеток. Поскольку эти вирусы заражают только делящиеся клетки, ретровирусные векторы используют в основном для трансдукции клеток ex vivo или для экспериментального лечения злокачественных новообразований.

Лентивирусы. Вирусы, относящиеся к этому подсемейству ретровирусов, способны заражать как делящиеся, так и неделящиеся клетки. Из лентивирусов лучше всего изучен ВИЧ-1, а векторы, полученные на его основе, теоретически обладают рядом преимуществ перед описанными ретровирусными векторами. Особенно многообещающей является их способность к высокоэффективной трансдукции стволовых кроветворных клеток. Эти векторы также могут обеспечить длительную экспрессию трансгена.

Аденовирусы. Аденовирусы содержат линейную двухцепочечную ДНК и способны к репродукции независимо отделения клетки-хозяина. Аденовирусные векторы имеют ряд преимуществ, что стимулирует разработку их клинического применения. Они позволяют доставлять гены в различные ткани человека, в том числе в эпителий дыхательных путей, эндотелий, миокард и скелетные мышцы, клетки периферической и центральной нервной системы, гепатоциты, экзокринные клетки поджелудочной железы и различные типы опухолей.

Аденовирусные векторы обеспечивают эффективную трансдукцию как делящихся, так и неделящихся клеток с последующей экспрессией трансгенов. Можно использовать разные пути введения, например в/в, внутрибрюшинный, внутрипузырный, внутричерепной, интратекальный, а также инъекцию в желчные пути или непосредственно в паренхиму органа. Многообразие путей введения позволяет выбрать наилучший для выбранной мишени. Аденовирусные векторы имеют два существенных недостатка. Во-первых, после заражения клетки вирусный геном не встраивается в ДНК клетки, поэтому длительной экспрессии трансгена не происходит. Во-вторых, аденовирусная инфекция активирует как клеточное, так и гуморальное звенья иммунитета, что ведет к уничтожению трансфицированных клеток и снижает эффективность повторного введения вектора. Побочные эффекты аденовирусных векторов также объясняются иммунным ответом. Аденовирусные векторы применяют для лечения как наследственных, так и приобретенных заболеваний, могут найти применение в лечении злокачественных новообразований.

Вирус простого герпеса. Этот вирус содержит большую (152 000 пар нуклеотидов) молекулу двухцепочечной ДНК, которая реплицируется в ядре зараженной клетки. Вирус заражает различные клетки, как делящиеся, так и неделящиеся; вирусный геном находится вне хромосом. В вирусный геном путем гомологичной рекомбинации или путем делеции и вставки можно встроить до 20 000—30 000 пар нуклеотидов чужеродной ДНК. Вирус простого герпеса типа 1 способен заражать различные клетки человека, но особенно выражена его тропность к нейронам, поэтому его предложено использовать в качестве вектора для генотерапии нервных болезней, например болезни Паркинсона или злокачественных новообразований мозга. Основные недостатки такого вектора — цитотоксичность и возможность замолкания трансгена. Вирус простого герпеса типа 1 способен заражать различные клетки человека, но особенно выражена его тропность к нейронам.

 

Семейство Рабдовирусы. Вирус бешенства. Структура вириона, культивирование. Резистентность к химическим и физическим факторам. Патогенность для человека, иммунитет, лабораторная диагностика, профилактика

Семейство Rhabdoviridae включает более 60 вирусов. В семействе выделяют два рода: Vesiculovirus и Lyssavirus. Различают два вируса бешенства: дикий вирус, циркулирующий среди животных, патогенный для человека; фиксированный – непатогенный для человека. Наибольшую опасность для человека представляет вирус бешенства.

Структура вириона. Рабдовирусы имеют пулевидную форму, размером 75-180 нм; спиральный тип симметрии, в состав генома входят однонитевая нефрагментированная (–)РНК. Наружная оболочка состоит из двойного липидного слоя, включающего внешние поверхностные гликопротеиновые структуры. Мембрану образуют поверхностный гликопротеин (G) и два негликозилированных белка (М1 и М2).

Культивирование. В лабораторных условиях вирус можно культивировать на лабораторных животных (мышатах, кроликах, хомячках, морских свинках и др.) Вирус репродуцируется в первичных и перевиваемых культурах клеток.

Резистентность. Вирус бешенства неустойчив: быстро погибает под действием солнечных и УФ-лучей, а также при нагревании до 60С. Чувствителен к дезинфицирующим веществам, жирорастворителям, щелочам и протеолитическим ферментам. Низкие температуры консервируют вирус.

Патогенез. Вирус, попав со слюной больного животного в поврежденные наружные покровы, реплицируется и персистирует в месте внедрения. Затем возбудитель распространяется по аксонам периферических нервов, достигает клеток головного и спинного мозга, где размножается. Клетки претерпевают дистрофические, воспалительные и дегенеративные изменения. Размножившийся вирус попадает из мозга по центробежным нейронам в различные ткани, в том числе в слюнные железы. Инкубационный период у человека при бешенстве — от 10 дней до 3 месяцев. Болезнь имеет три периода: продромальный (период предвестников) длится 1-3 дня. Стадия разгара (гидрофобия) длится 1-3 дня. Период параличей (стадия «зловещего успокоения»), при котором наступает смерть. Общая продолжительность болезни – 5-8 дней, изредка 10-12 дней.

Иммунитет. Человек относительно устойчив к бешенству. Постинфекционный иммунитет не изучен, так как больной обычно погибает. Введение людям, укушенным бешеным животным, инактивированной антирабической вакцины вызывает выработку антител, интерферонов и активацию клеточного иммунитета.

Лабораторная диагностика. Для исследования на бешенство направляют в лабораторию свежие трупы мелких животных. Лабораторная диагностика включает: обнаружение вирусного антигена в РИФ и РДП, телец Бабеша—Негри и биопробу на белых мышатах.

Вирусоскопический метод. Выявление вирусного антигена в пораженных тканях и в слюнных железах проводят с помощью реакции иммунофлюоресценции, ПЦР, ИФА.

Биологический метод проводят при отрицательных результатах вирусоскопии. Материал – эмульсию мозга, слюну вводят внутрицеребрально белым мышам или кроликам. Они быстро погибают и при вскрытии обнаруживают тельца Бабеша-Негри. Для идентификации вируса ставят реакцию нейтрализации на белых мышах, ПЦР, ИФА.

Серологический метод диагностики используют только для определения уровня иммунитета у людей и животных после вакцинации, ставят РН. ИФА, РИА.

Профилактика. Выявление, уничтожение больных животных. В настоящее время для профилактики бешенства применяют инактивированные и живые вакцины. Условно вакцины можно разделить:

-на вакцины первого поколения, которые готовят из головного мозга животных, инфицированных фиксированным вирусом бешенства;

-вакцины второго поколения, которые готовят из штаммов вируса бешенства, адаптированных к культуре клеток;

-вакцины третьего поколения, которые получают с помощью генно-инженерных методов.

 

Вирусные инфекции животных. Семейство Пикорнавирусы. Вирус ящура. Резистентность к химическим и физическим факторам. Патогенность для человека, иммунитет, лабораторная диагностика, профилактика

В семействе имеются роды: Enterovirus,Parechovirus,Hepatovirus, Rhinovirus, Cardiovirus, Aphtovirus.

Вирус ящура относится к семейству Picornaviridae, роду Aphtovirus.

Структура вириона. Геном представлен единой односпиральной линейной плюс-РНК. Вирионы вируса представляют собой лишенные суперкапсидной оболочки частицы кубической симметрии диаметром 22—30 нм. Основные структурные белки вируса ящура - VP1, VP2, VP3 и VP4.

Культивирование. Вирус культивируется на естественно восприимчивых и лабораторных животных: новорожденных мышатах и крольчатах, хомяках 60-дневного возраста, взрослых морских свинках. Хорошо размножается в культуре клеток почек восприимчивых животных, в культуре эксплантантов эпителия языка крупного рогатого скота и в некоторых перевиваемых линиях клеток (ВНК-21, СПЭВ и др.) с выраженным цитопатическим действием.

Резистентность. Возбудитель ящура устойчив к высушиванию и замораживанию, но быстро погибает при нагревании до 60С, действии УФ-лучей и обычных дезинфицирующих веществ, дезинфектантов.

Патогенез. Входными воротами для вируса служат в первую очередь слизистые оболочки ротовой полости и дыхательных путей. Первичная репродукция вируса происходит уже через 18 ч после заражения в слизистой оболочке глотки, в лимфоузлах и миндалинах головы и шеи. В местах внедрения вируса образуются первичные афты. Из места первичной локализации вирус по лимфотическим путям попадает в кровь и затем в органы лимфоидномакрофагальной системы, где имеются оптимальные условия для обильного накопления вируса и образования очага инфекции, предшествовавшего развитию повторной виремии. Обладая миотропными свойствами, вирус ящура также фиксируется в волокнах сердечной и скелетной мышц, вызывая различные функциональные нарушения сердечной деятельности и тканевые дефекты. Продолжительность инкубационного периода длится от 2 до 6 дней.

Иммунитет. Перенесенное заболевание оставляет после себя кратковременный, обычно до полутора лет, иммунитет по отношению к вирусу того типа, которым заболевание было вызвано. Повторные случаи заболевания по нескольку раз подряд возможны из-за различия типов ящурного вируса.

Лабораторная диагностика. Патологический материал: кровь, стенки и содержимое афт, кусочки сердечной мышцы, на вирусоносительство – соскобы со слизистой оболочки глотки или пищевода.

Схема лабораторной диагностики.

I. Экспресс-методы: РИФ, РСК.

II.Вирусологические исследования: 1) выделение вируса на мышатах-сосунах, морских свинках, крольчатах, культуре клеток свиной почки и щитовидной железы, естественно-восприимчивых животных; 2) идентификация выделенного вируса в РСК, РДП, РПГА, РН.

III. Ретроспективная диагностика: РДСК, РДП, РИД, РНИФ, РП.

Профилактика. Заключается в соблюдении мер личной предосторожности в очаге и санитарно – ветеринарных мероприятиях. В эндемичных районах обязательны пастеризация и кипячение молока, приготовление масла из обработанных сливок, а также тщательное соблюдение мер безопасности при уходе за больными животными.

 

Семейство Togaviridae. Вирус краснухи. Структура вириона, культивирование. Резистентность к химическим и физическим факторам. Патогенность для человека, иммунитет, лабораторная диагностика, профилактика

Семейство Togaviridae (от лат. toga - плащ) - большая группа вирусов, поражающая позвоночных и членистоногих многих видов. Семейство Togaviridae включает два рода: Alphavirus и Rubivirus.

Вирус краснухи – единственный представитель рода Rubivirus, возбудитель - Rubella virus.

Краснуха (лат. rubella - «маленький красный») или третья болезнь или немецкая корь – это острая вирусная инфекция, преимущественно отмечающаяся у детей, и относящаяся к разряду детских инфекций. Проявляется респираторными проявлениями, лимфаденопатией, интоксикацией и специфической сыпью.

Структура вириона. Вирус имеет сложную организацию. Вирион вируса сферической формы, размер 50-70 нм. Геном вируса представлен однонитчатой плюс-нитевой РНК, окруженной капсидом с кубическим типом симметрии и внешней липидсодержащей оболочкой, на поверхности которой находятся гликопротеиновые шипы длиной 6-10 нм.

Антигенная структура. Вирус имеет 2 антигена:

1. Внутренний (серцевинный) нуклеокапсидный антиген С, выявляется в РСК;

2. Внешние гликопротеиновые антигены Е1 и Е2, выявляется в РН и РТГА.

Существует один серотип вируса (группа микроорганизмов одного вида, объединяемых общей антигенной структурой, определяемой серологическими методами диагностики), обладающий гемагглютинирующей, гемолитической и слабо выраженной нейраминидазной активностью.

Культивирование. Вирус растет в первичной культуре клеток амниона человека (амнион - временный орган, обеспечивающий водную среду для развития зародыша), перевиваемых культурах клеток (клетки, способные к размножению вне организма неопределенно длительное время) почек кролика, почек обезьян Vero. В пораженных клетках отмечено цитопатическое действие вируса (ЦПД): дегенерация, появление гигантских многоядерных клеток и образование цитоплазматических эозинофильных включений.

* Вирус способен размножаться в организме некоторых лабораторных животных (хомячков, крыс, кроликов и обезьян), у которых инфекция обычно протекает бессимптомно.

Вирус краснухи патогенен для человека, обезьян (макак) и кроликов.

Резистентность. При низких температурах в замороженном состоянии сохраняет активность годами (-70оС). Вирус чувствителен к эфиру, детергентам (поверхностно-активные вещества); инактивируется при температуре 56°С в течение 30 мин, при 70°С в течение 4 мин и при 100°С за 2 мин; разрушается под дейс-твием органических растворителей (70% этиловым спиртом), хлорактивных соединений (1% раствором гипохлорита натрия), формалина, УФ-лучей, солнечного света; нестабилен в кислой (рН ниже 5,0) и щелочной (рН выше 8,0) средах, при высушивании; неустойчив в окружающей среде (при комнатной температуре).

Патогенез. Патогенез приобретенной краснухи. Входные ворота - слизистая оболочка верхних дыхательных путей. Первичная репродукция и накопление вируса в шейных, затылочных и заушных лимфатических узлах («краснушные рожки») – лимфаденопатия (лимфоузлы увеличиваются в размерах, при пальпациии болезненны). Далее вирусы попадают в кровяное русло и распространяются с током крови по всему организму (вирусемия). Обладая лимфо- и дерматотропностью, вирусы оседают в лимфатических узлах и эпителиальных клетках кожи. Здесь развивается иммунная воспалительная реакция, сопровождающаяся появлением пятнисто–папулёзной сыпи. С появлением сыпи вирусемия заканчивается, что связано с образованием в крови нейтрализующих антител.

Патогенез врожденной краснухи. Заражение беременной, вирусемия - трансплацентарное попадание вируса в эмбрион - инфицирование эндотелия сосудов плаценты (клеток эмбриональной ткани) с последующим развитием хронической ишемии тканей и органов плода - деструктивное действие вируса с нарушением митотической активности клеток, хромосомными изменениями, приводящими к гибели плода или формированию у ребенка тяжелых ВПР; в первую очередь поражаются критические органы.

Иммунитет. В случае приобретенной краснухи - стойкий пожизненный, антитела сохраняются в течение всей жизни.В случае врожденной краснухи - менее стоек, так как его формирование происходит в условиях незрелой иммунной системы плода.

Лабораторная диагностика. В лабораторной диагностике краснухи используются:

* серологические методы;

* молекулярно-генетические методы;

* биологические методы.

Серологические методы. Для серодиагностики краснухи используется, в основном, три метода: реакция нейтрализации (РН), реакция торможения гемагглютинации (РТГА) и иммуноферментный анализ (ИФА).

Молекулярно-генетические методы исследования (ПЦР-диагностика). На сегодняшний день самым надежным и распространенным методом обнаружения возбудителя краснухи является полимеразная цепная реакция (ПЦР). С ее помощью можно выделить геном вируса и поставить соответствующий диагноз. Это наиболее специфичный и чувствительный тест. Несмотря на все это, у него есть один недостаток - высокая стоимость.

Биологические методы. Основаны на культивировании вируса в культуре клеток с последующим выявлением его цитопатического действия и на исследовании лабораторных животных с целью изучения патогенности вируса.

Профилактика. Основным методом является вакцинация. Вакцинация против краснухи проводится комбинированной живой вакциной от кори, краснухи и паротита двукратно: первый раз в возрасте 12-16 месяцев, затем ревакцинация в 6 лет.

 

Семейство Парамиксовирусы. Вирус парагриппа. Структура вириона, культивирование. Резистентность к химическим и физическим факторам. Патогенность для человека, иммунитет, лабораторная диагностика, профилактика

В семейство Paramyxoviridae (от греч. para - около и myxa - слизь) включены 4 рода, включающие возбудителей, патогенных для человека: Paramyxovirus – (вирусы парагриппа 1 и 3 серотипов), Rubulavirus (вирусы парагриппа 2 и 4 типов и вирус эпидемического паротита),Morbillivirus – (вирус кори, подострого склерозирующего панэнцефалита, чумы крупного рогатого скота и собак),Pneumovirus – респираторно-синтициальный вирус (RS). Они передаются респираторным механизмом.

Парагрипп – острое респираторное вирусное заболевание, поражающее органы дыхания - нос и гортань, проявляющаяся катаральными и интоксикационными признаками.

Морфология. Вирус парагриппа являются сложным. Тип симметрии нуклеокапсида – спиральный. Для вирионов характерен плеоморфизм (разнообразие форм). Диаметр вириона – 150-200 нм. Тип нуклеиновой кислоты – одноцепочечная (–)РНК. В состав вириона входит шесть разных структурных белков:

1) Геммаглютинин-нейраминидаза (HN, обеспечивает прикрепление к рецепторам клеток-хозяев, обладает гемагглютининной и нейраминидазной активностью).

2) Протеин (белок) слияния F-белок (F, вызывает слияние с мембраной клетки- хозяина, проникновение внутрь, гемолиз).

3) Матриксный белок (M, структурный компонент вириона).

4) Нуклеопротеин (NP, тесно связан с нуклеиновой кислотой, структурный компонент нуклеокапсида).

5) Фосфопротеин (P, часть РНК-полимеразного комплекса).

6) Большая субъединица РНК-полимеразы (L, часть РНК-полимеразного комплекса).

Культивирование. Вирусы размножаются в основном в первично трипсинизированных клеточных культурах. Наиболее чувстивительны культуры почек макак резусов, менее чувствительны культуры клеток почек эмбриона человека и морских свинок. Еще менее чувствительны перевиваемые культуры клеток человеческого происхождения (Hela, KB, Hep-2) и почек обезьян (Vero, BSC-1), в которых размножается только вирусы типа 2.

Антигенная структура. Антигенными свойствами у вирусов парагриппа обладают гликопротеины суперкапсида: геммаглютинин, нейраминидаза и F-белок. На основе изучения антигеннной и генетической структуры выделяют 4 типа вирусов парагриппа, два из которых (HPIV-1 и HPIV-3) относятся к роду Respirovirus, а два других (HPIV-2 и HPIV-4) – к роду Rubulavirus.

Резистентность. Вирусы относительно нестойки, быстро инактивируются в кислой среде и при нагревании, разрушаются эфиром, хлороформом, детергентами, но при лиофилизации вирусы сохраняют инфекционную активность в течение нескольких лет при температуре 4 °C.

Патогенез. Заражение – воздушно-капельным путем или при прямом контакте. Воротами инфекции являются слизистые оболочки респираторного тракта, особенно носа и гортани, где возникают выраженные воспалительные изменения. Парагриппозные вирусы репродуцируются в клетках эпителия дыхательных путей, разрушая при этом сами клетки. Размножившиеся вирусы и продукты распада эпителиальных клеток частично проникают в кровь, способствуя развитию лихорадки и других симптомов интоксикации, которая при парагриппе слабо выражена. У детей из-за отека слизистой оболочки гортани и ее воспалительной инфильтрации может возникнуть синдром «ложного крупа». Клинически появляется кашель, охриплость голоса. Инкубационный период колеблется от 2 до 7 дней, чаще 3-4 дня.

Иммунитет. Парагрипп обычен для детей от 6 месяцев до 5 лет, однако вырабатываемый иммунитет является неполным, то есть, возможно, повторное заражение, но у взрослых парагрипп обычно протекает в более мягкой форме.

Лабораторная диагностика. Точную идентификацию возбудителя проводят посредством реакции связывания комплемента (РСК) или методом иммуноферментного анализа:

При РСК исследование проводят в начале заболевания и через 5-7 дней, диагностическим считается нарастание титра антител не менее чем в 4 раза при исследовании парных сывороток. По сравнению с РСК метод ИФА отличается большей чувствительностью. Как и при РСК, требуется сравнение уровня антител в пробах сыворотки, полученных от больных в начале и конце заболевания.

Лечение и профилактика. Симптоматическая терапия (прием жаропонижающих, сосудосуживающих при насморке, обезболивающих препаратов), при выраженном крупе может потребоваться применение стероидных препаратов (дексаметазон), ингаляция адреналином или даже эндотрахеальная интубация, при сопутствующей бактериальной инфекции – антибиотики. Несмотря на попытки, клинически применяемая вакцина не разработана.