Определение спектра поглощения и эмисии SYBRgreen

В RealTimeПЦР используют как описано выше несколько видов зондов. В своих исследованиях мы использовали SYBR Green. При выборе зондов мы руководствовались несколькими параметрами, в том числе стоимость, совместимость с системой детекции и т.д. Технологии Molecular beacons и LightCycler стоят ощутимо дорого, и их осмысленно применять лишь в том случае, когда требуется крайне специфичная детекция лишь одного из образующихся PCR-продуктов (например, при анализе SNP). Методики SYBR Green и TaqMan стоят дешевле, однако каждый из них имеет свои особенности. В таблице 1, приведенной ниже, сравниваются методики SYBR Green и TaqMan. В наших исследованиях мы использовали эти системы. Они активно используются в RealTimeПЦР для определения количественных параметров ПЦР непосредственно в ходе реакции. Однако мы для решения поставленных задач пользовались этими методиками для детекции сигнала по конечной точке.

В своей работе мы использовали флуоресцентный интеркалирующий краситель SYBRgreen (10000 кратный сток производства фирмы «ДНК-синтез») и набор компонентов для проведения ПЦР с использованием TaqMan, синтезированных компанией «Синтол» (наработанный продукт амплификации имеет размер около 100 п.н.).

Краситель SYBR Green - исключительно чувствительный флуоресцентный индикатор двухцепочечной ДНК. Применяется для realtime-PCR, а также для прокраски гелей (как агарозных, так и полиакриламидных). Предел обнаружения двухцепочечной ДНК для SYBR Green составляет 1-2 нанограмма для коротких синтетических олигонуклеотидов и до 20 пикограмм высокомолекулярной природной ДНК. SYBR Green I обладает существенно высокой специфичностью в отношении ДНК-дуплекса и является более безопасным по сравнению с другими красителями – он не оказывает высокого уровня мутагенного действия.

Данные о флуоресценции: максимум флуоресценции в комплексе с ДНК составляет 521 нм, максимум возбуждения - 497 нм (второй максимум около 254 нм). Хорошо возбуждается стандартным 488-нм лазером. Квантовый выход флуоресценции - около 0.8 (что в 5 раз превышает квантовый выход комплекса этидий-ДНК). Обычно SYBR Green хорошо работает примерно до C(T) = 35-37, затем точность начинает падать. Диапазон достоверности результатов легко проверить для каждой конкретной пары праймеров, проведя несколько независимых real-time PCR.

В системе TaqMan использовали зонд, меченный красителем FAM и имеющий следующую последовательность:

5^’(FAM) – СTT GAA AGA TCT GCT AGA GTC AGC TTG TCA GCG – (TAMRA) – 3^’. Длина 33 нуклеотида. Молекулярный вес 10137. Длина волны возбуждения FAM 470 нм, длина волны эмиссии 525 нм.

Перед работой определяли спектр поглощения и испускания света интеркалятора на приборе Perkin Elmer MPF-44-B Fluorescence Spectrophotometer. Результаты измерений представлены на рис. 13.

Рис. 13. График зависимости сигнала фотодетектора от длины волны.

На рисунке синей кривой показан спектр поглощения света красителем. Кривая получена при эмисии образца 520нм. Видно что SYBR поглощает свет длинной 260нм (первый пик). Второй пик приходится на 470 и 495 нм. Зеленая кривая показывает спектр испускания длины волны. Согласно ей, интеркалятор испускает свет с длиной волны 520 нм. Эта кривая получена при возбуждении образца длинной волны 470 нм.

2.3. Протоколы полимеразной цепной реакции:

2.3.1. Постановка реакции с использованием фирменного набора(система SYBgreen)

 Для ПЦР в качестве матрицы использовали плазмиду pcDNA3 cavmut – плазмидный вектор, содержащий кДНК мутантного кавеолина (P132L) человека (исходная концентрация 0,7 мг/мл), пару праймеров pc1(исх.конц. 31 мкМ) и pc2 (исх.конц. 12 мкМ), SYBRgreen (10000 кратный раствор) и taq-полимеразу. Фермент поставляется фирмой Sigma в наборе c буфером в лиофильном состоянии в комплекте с растворителем. Кит рассчитан на общий объем смеси 20 мкл. Амлифицировался участок (фрагмент) размером около 650 п.н.

Постановка ПЦР:

· 7 нг матрицы,

· 0,2мкМ pc1,

· 0,2мкМ pc2,

· деионизированная (milliQ) дистиллированная вода до 10 мкл,

· 10мкл растворителя,

· 0,2мкл SYBRgreen (разведенного в 100 раз).

Для эксперимента использовались микропланшеты собственного изготовления. В качестве контроля служила лунка с ПЦР-ной смесью без матрицы. Для отработки условий ПЦР в микрообъеме проводили 30 циклов. Регистрацию флуоресценции проводили по конечной точке. Температурный режим (1 цикл):

2.3.2. Постановка реакции без использования фирменного набора(система SYBRgreen)

 В качестве матрицы использовали плазмиду pcDNA3 cavmut (исходная концентрация 0,7 мг/мл), пару праймеров pc1 (исх.конц. 31мкМ) и pc2 (исх.конц. 12 мкМ), SYBRgreen и комплекс фермента (taq-полимераза) с антителами – так называемый Hotstart, 10-кратный сток буфера, растворы dNTP и MgCl₂. Связывание полимеразы с антителами нужен для того, чтобы фермент начинал свою работу только при высоких температурах (первая температура каждого цикла реакции – 94^оС), а при комнатной оставался неактивным. Общий объем смеси 20 мкл. Амлификации поддавался участок размером около 650 п.н.

Постановка ПЦР:

· 7 нг матрицы,

· 0,2 мкМ pc1,

· 0,2 мкМ pc2,

· деионизированная (milliQ) дистиллированная вода до 14 мкл,

· 2 мкл SYBRgreen,

· 2 мкл буфера (сток х 10),

· 2 мкл 2мМ MgCl₂,

· 0,2 мкл taq-полимеразы (5Е/мл),

· 0,4 мкл 0,2мМ dNTP (нуклеотидтрифосфоты).

Для эксперимента использовались микропланшеты собственного изготовления. В качестве контроля служила лунка с ПЦР-ной смесью без матрицы. Для отработки условий ПЦР в микрообъеме проводили 30 циклов. Регистрацию флуоресценции проводили по конечной точке.

Температурный режим (1 цикл):

2.3.3. Протокол полимеразной цепной реакции с использованием TaqMan.

На одну пробу объемом 20 мкл смешивают:

· 8,75 мкл смеси А,

· 8,75 мкл смеси Б,

· 0,2 мкл Taq-полимеразы,

· 2 мкл ДНК.

2.4 Электрофоретическое разделение нуклеиновых кислот в 8% ПААГ

Для приготовления геля было использовано.

Собирали кассету с вертикальными пластинками. В гель вносили полимеризаторы, перемешивали и заливали 4.2 мл между пластин. После полной полимеризации геля между стекол вставляли гребенку. После полимеризации геля пластины извлекали из кассеты и помещали в камеру для электрофореза. Заливали электродный буфер следующего состава:

0,5 М ЭДТА, рН=8.0,

0,4 Borie Acid,

0,4 Tris.

Извлекали гребенку из геля, не деформируя карманы. Пипеткой или шприцем промывали карманы от неполимеризовавшейся жидкости электродным буфером. Вносили ДНК пробы в карманы пипеткой, V=5 мкл. Подключали камеру к источнику тока. Электрофорез проводили от минуса к плюсу при постоянной силе тока I=20мA на одну пластину, пока лидирующий краситель не выходил из геля (бромфеноловый синий), около 40 минут.

 2.5. Система детекции результатов анализа

После амплификации регистрацию флуоресцентного сигнала проводили на экспериментальной установке, собранной на базе бинокулярного микроскопа МБС-11 (Россия ) c телевизионным адаптором TV-A и камерой фирмы «Wateс» (Japan) WAT-120 N. Сигнал с камеры подавался на плату видеозахвата «PixelView CX 881 P», находящийся на шине IDE персонального компьютера типа IBM PC. С помощью установки регистрировали сигнал (возбуждение – 470 нм, эмиссия – 520 нм), обрабатывали с помощью программы «Qwantа» (оригинальная разработка лаборатории).

Он поделен на 4 части. Первая –Capture window – это онлайн окно, в поле которого проэцируется изображение лунки с образцом. Левое темное поле – это поле захвата изображения. Здесь с помощью настроек можно указывать расположение области измерения, границы которого обозначены зеленой окружностью, устанавливать размер и сохранять изображение. Нижние поля – «расчетные данные эксперимента» и «измерения в текущем кластере» дают возможность снимать показания измерений и манипулировать их расчетами. Программа так же позволяет снимать запоминать и обрабатывать показания флуоресценции не только с одного, как показано на рисунке, но и с нескольких рядов лунок с образцами.

Оборудование состоит из двух корпусов. Корпус номер 2 имеет предметный столик, куда кладется анализируемый чип. На корпусе 1 закреплены светодиодная матрица и цифровая ТV-камера. Обьектив камеры имеет съемные оптические фильтры. При анализе образцов с SYBRgreen использовали зеленый светофильтр, соответствующий длинне волны испускаемого им света. Светодиодная матрица состоит из нескольких источников света, длина волны которого соответствует спектру возбуждения красителя. На рисунке это изображено синими стрелками. Зелеными показана эмиссия.