| Факультет Естественно-географический | Кафедра Биохимии |
|
Дипломная работа
Разработка условий оптимизации процесса амплификации ДНК
| |
| Студент _____________________________________________ Венедиктов А.А. подпись
| |
| Руководитель _________________________________________ Белецкий И.П. подпись К защите допустить. Протокол № от «____» ___________200_г. | |
| Зав. кафедрой _________________________________________ Генгин М.Т. подпись | |
|
Пенза, 2008 г. | |
Содержание
Введение
Глава 1. Обзор литературы
1.1 Real Time ПЦР
1.1.1 Виды RealTime ПЦР
1.1.2 Кинетические параметры
1.2 Биологические микрочипы
1.2.1. ДНК-микрочипы
1.2.2. Гибридизация-основа технологии
1.2.3. Применение ДНК-чипов
Глава 2. Материал и методы
2.1 Изготовление микропланшетов
2.2 Определение спектра поглощения и эмиссии SYBR green
2.3 Протоколы ПЦР
2.3.1 Постановка реакции с использованием фирменного набора(системаSYB green)
2.3.2 Постановка реакции без использования фирменного набора(системаSYBgreen )
2.3.3 Протокол полимеразной цепной реакции с использованием TaqMan
2.4 Электрофоретическое разделение нуклеиновых кислот в образцах ПЦР-смеси после амплификации
2.5 Система детекции результатов анализа
Глава 3. Результаты и обсуждение
3.1 Определение зависимости сигнала флуоресценции от концентрации ДНК
3.2 Проведение ПЦР в разных объемах смеси в пробирках
3.3 Проведение ПЦР в пластиковых микропланшетах
3.4 Постановка ПЦР в микрообъемах с отрицательными контролями
3.5 Электрофоретическое разделение нуклеиновых кислот в образцах ПЦР-смеси после амплификации
Выводы
Заключение
Список литературы
Введение.
С возникновением принципиально новых направлений в науке, в клинической диагностике успешно начали применяться методы ДНК-технологий среди которых, безусловно, первое место занимают полимеразная цепная реакция (ПЦР). Не менее мощным и уникальным по своим характеристикам методом является анализ с использованием биологических микрочипов. Этот метод появился сравнительно недавно, но уже интенсивно применяется в практике.
В основе всех ДНК-технологий, лежат процессы амплификации и регистрации молекул ДНК.
Оптимизация условий данных процессов позволит увеличить производительность, снизить стоимость анализа и повысить его качество. Одним из возможных путей решения этого вопроса является объединение в единую технологическую схему современных подходов в детекции ДНК.
В настоящее время возможные применения подобных схем находятся на стадии разработки в ряде зарубежных лабораторий. Наиболее вероятным направлением ближайшего их применения является молекулярная диагностика наследственных заболеваний и другие практические приложения, основанные на выявлении однонуклеотидных полиморфизмов последовательностей ДНК человека.
Цель работы – это попытка создать модель диагностической системы за счет объединения преимуществ двух методов – количественного вида ПЦР – Real Time и биочипового анализа, в связи с чем были поставлены следующие задачи : изготовление микропланшетов с лунками, общий объем которых не должен превышать 2мкл (в настоящее время используются микроплашки с лунками, рассчитанные на 200 мкл), перевод реакции в формат микрочипа и отработка условий ПЦР в микрообъеме (обычно ПЦР ставят в объеме 20-30 мкл,в формате биочипа общий объем реакционной смеси не должен превышать 1-2 мкл).
Работа выполнялась на базе лаборатории клеточной инженерии Института Теоретической и Экспериментальной Биофизики РАН, г. Пущино.
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
RealTime ПЦР
Принцип метода полимеразной цепной реакции был разработан Кэри Мюллисом в 1983 г. Первые сообщения по практическому применению метода появились в 1985 г.[18] С тех пор количество публикаций, где ПЦР используется в качестве одного из методов исследования, занимает одно из первых мест наряду с работами, в которых применяются автоматическое определение нуклеотидной последовательности (сиквенирование ДНК) и гибридизационные технологии.[7]Существует большое количество способов получить данные о концентрации нуклеиновых кислот в пробе методом ПЦР, но все они требуют дополнительных трудоемких этапов работы, связанных с предварительной раститровкой выделенной из анализируемой пробы ДНК, или полученных в ходе ПЦР ампликонов, что приводит к увеличению времени, необходимого для постановки анализа и сложности интерпретации полученных результатов [12,15]. Также, наличие дополнительных этапов работы увеличивает вероятность ошибки и получения недостоверного результата.
На сегодня существует метод, лишенный вышеперечисленных недостатков - это метод ПЦР в реальном времени (Real-Time PCR) [14]. Сущность метода заключается в исследовании накопления продуктов амплификации с помощью специального прибора без последующего электрофореза. Так как кинетика накопления продуктов амплификации связана с исходным количеством матрицы, это дает возможность точно оценить её количество [13].
Отличительными чертами данного метода, в отличие от классической ПЦР, является возможность количественного определения ДНК/РНК инфекционных агентов в исследуемом материале, отсутствие стадии электрофореза, менее строгие требования к организации ПЦР-лаборатории и автоматическая регистрация и интерпретация полученных результатов.
Отсутствие стадии электрофореза позволяет минимизировать риск контаминации продуктами ПЦР и таким образом резко уменьшить число ложноположительных результатов. Поскольку регистрация результатов проводится непосредственно в процессе ПЦР, весь анализ можно проводить в одной-двух комнатах лаборатории и нет необходимости в отдельном помещении для детекции продуктов реакции.
Использование математических методов анализа позволяет проводить автоматическую интерпретацию полученных результатов и снимает проблему субъективной оценки электрофореграмм.
Виды RealTime ПЦР
Для выявления продуктов амплификации в режиме реального времени используют следующие наиболее распространенные подходы.
Выщепление 5' концевой метки (TaqMan Assay).
Данная методика основана на использовании 5'-экзонуклеазной активности полимеразы. В реакционную смесь добавляют ДНК-зонды, в состав которых входит флуоресцентная метка в 5'-положении и гаситель флуоресценции в 3'-положении, а также фосфатная группа в 3'-положении. Эти зонды имеют места посадки внутри амплифицируемой области. Гаситель поглощает испускаемое флуоресцентной меткой излучение, а фосфатная группа в 3'-положении блокирует полимеразу (Рис. 1) В ходе ПЦР во время стадии отжига праймеров происходит присоединение ДНК-зонда к комплементарной цепи ДНК, причем чем больше продуктов амплификации образуется в ходе ПЦР, тем больше молекул зондов свяжется с соответствующими ампликонами. Во время стадии элонгации полимераза синтезирует комплементарную цепь ДНК и при достижении зонда начинает его расщеплять благодаря наличию 5'-экзонуклеазной активности. Таким образом происходит разъединение флуоресцентной метки и гасителя, что приводит к увеличению детектируемого свечения [13]. Очевидно, что чем больше ампликонов было наработано в ходе ПЦР на данный момент времени, тем интенсивнее будет свечение[19].
Рис. 1. Схема ПЦР в реальном времени с использованием зонда TaqMan.[7]
С помощью серийных разведений образцов ДНК определили чувствительность системы ПЦР в реальном времени, которая в обсуждаемой модели позволяла обнаруживать 0,28 нг (приблизительно 20 копий ) ДНК в пробе[8]
 2019-12-29 |
 220 |
 Обсуждений (0) |
из
5.00
|
Обсуждение в статье: Выщепление 5' концевой метки (TaqMan Assay). |
|
Обсуждений еще не было, будьте первым... ↓↓↓ |
Почему 1285321 студент выбрали МегаОбучалку...
Система поиска информации
Мобильная версия сайта
Удобная навигация
Нет шокирующей рекламы
