ПЦР ставили по протоколам с использованием SYBRgreen и TaqMan. Общий объем ПЦР смеси составлял 1 мкл. Количество внесенной матрицы одинаково – 7 нг. Контролем служили пробы без матрицы. Измерение и регистрацию флуоресцентного сигнала проводили с помощью описанной системы детекции и программы «Qwantа». Результаты измерений представлены в таблице 5.
По данным таблицы видно, что приращение сигнала флуоресценции сопоставимо с измерениями, полученными при проведении ПЦР в капле смеси объемом 1 мкл в среде масла в обоих случаях. А значит амплификация проходит с не меньшей эффективностью чем на моделях с каплями. Сильный разброс значений в случае SYBRgreen лишний раз доказывает, что работа с микрообъемами – это очень сложный процесс, где даже самые минимальные погрешности в работе (погрешности пипеток, чистота преперата и т.д.) становятся критичными и влияют на результат.
Таблица 5.
SYBRgreen
С матрицей (флуоресценция, у.е.)
Среднее значение (среднее отклонение)
Без матрицы (флуоресценция, у.е)
Среднее значение (среднее отклонение)
Приращение (флуоресценция, у.е)
Среднее значение(среднее отклонение)
41
40,8(3)
34
35,4(4)
7
5,4(3,5)
40
31
9
38
36
2
44
39
5
41
37
4
TaqMan
С матрицей (флуоресценция, у.е)
Среднее значение (среднее отклонение)
Без матрицы (флуоресценция,у.е)
Среднее значение (среднее отклонение)
Приращение (флуоресценция,у.е)
Среднее значение(среднее отклонение)
82
89,2(8,5)
57
58,2(1,5)
25
31(19)
99
55
44
91
60
31
89
60
29
85
59
26
Электрофоретическое разделение нуклеиновых кислот в образцах ПЦР-смеси после амплификации
ПЦР ставили по протоколам с использованием SYBRgreen и TaqMan. Амплификация проходила в микропланшетах в объеме смеси – 1 мкл (на геле эти образцы обозначены прописной буквой «ч») и как контроль в амплификаторе «ТерЦик» под минеральным маслом в объеме 20 мкл(на геле – это образцы с индексом «а»). Заглавные буквы T и S означают ПЦР с системой TaqMan и SYBRgreen соответственно. Индексы 1, 2 и 3 в системе TaqMan означают использование разных растворов полимераз и в принципе важного значения для этого опыта не имеют, поэтому их можно расценивать как 3 повтора. Индекс «чдо» у одного из S означает ПЦР-смесь до амплификации. В карман геля наносили по 5 мкл образца. М – маркер – смесь нуклеиновых кислот размером от 50 до 1000 п.н.
На рис. видно, что амплификация прошла во всех пробах системы TaqMan. Шесть полос, проявившихся на геле чуть ниже уровня полосы маркера с цифрой 100 означают, что во всех этих пробах прошла реакция и наработался фрагмент ДНК размером около 100 п.н. На дорожках, куда вносили пробы после амплификации в «Терцике» полосы проявились сильнее, чем на дорожках с пробами из чипа. Значит наработанного фрагмента в плашках меньше, чем в макрообъеме под маслом. Это обстоятельство опять же объясняется форматом микрообъемов, где погрешности каждого из этапов работы становится критичным. В случае с SYBRgreen также наблюдается подобная картина. Полоски не проявились в случае с образцом не прошедшим амплификацию и проявились на дорожках лунок, куда вносили образцы после амплификации. Следовательно амплификация в них прошла и наработался фрагмент размером около 600 п.н.
Гель фотографировали с зеленым светофильтром, пропускающим соответствующую длину волны красителя (520 нм). На геле хорошо заметны зеленые полосы крашенной наработанной в процессе амплификации ДНК и исходной матрицы(полосы в самом начале карманов), которая имеет большой размер (5000 п.н.) и за время разделения успела только войти в гель. Опять же количество наработанного фрагмента в чипе меньше (хоть и не значительно по сравнению с системой TaqMan), чем в макрообъемной ПЦР-смеси. Однако нужно обратить внимание на то, что верхняя полоса в лунке S18ч окрашена слабее, чем в лунке S18а. Это говорит о том, что изначально количество матрицы в образце было меньше, что опять же связано с погрешностями в работе с микрообъемами.
Выводы.
· Созданы экспериментальные образцы микропланшетов, позволяющие проводить полимеразную цепную реакцию в общем объеме ПЦР-смеси – 1 мкл.
· Подобраны условия эффективной полимеразной цепной реакции в объеме реакционной смеси 1 мкл.
· Отработаны условия ПЦР в микрообъеме (1 мкл) – формате биологических микрочипов.
Заключение.
Сейчас без преувеличения можно сказать: развитие "технологии манипулирования с наследственной информацией" сравнимо по темпам роста с микроэлектроникой и информатикой, нередко эффективно сочетается с ними. И только уникальное сочетание преимуществ традиционных методов и технологий приведет человека к решению ранее недоступных задач в этой интересной и перспективной области. Подобные направления позволяют устанавливать структуру и изучать процессы на уровне генов всего генома, белков всей клетки или клеток всей ткани.
В ходе выполненной работы создана система, которая позволила объединить преимущества таких методов как RealTime ПЦР и микрочипового анализа. Внедрение основы этой разработки в медицину может положить начало создания уникальных тест систем и инструментов клинической диагностики. Количественный ПЦР особенно необходим для обнаружения и мониторинга некоторых вирусных заболеваний ( таких как вирусный гепатит С и В, СПИД). Биочип является уникальным устройством, позволяющим проводить одновременно большое количество анализов на одной подложке. Перевод количественного ПЦР в формат чипа сделает анализ быстрым и экономичным.
Список литературы
1. А.Шляпникова, Ю.М.Шляпников, В.Н.Афанасьев, Г.В.Афанасьева, А.В.Гаврюшкин, И.П.Белецкий. «Исследование качества амино-модифицированных подложек, используемых для гибридизационного анализа» Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН. УДК 547.963.3
2. Шляпникова Е.А., Шляпников Ю.М., Грановский И.Э., Афанасьева,Г.В., Гаврюшкин А.В., Белецкий И.П «Биологические микрочипы в медицине» Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН.
3. Шишкина И.Г., Левина А.С., Зарытова В.Ф. «Аффинные сорбенты, содержащие нуклеиновые кислоты и их фрагменты» // Успехи химии//2001 г. №70(6), с.581,.
4. Иванов, И., Ершов Г., Барский, В., Бельговский, А., Кириллов, Е., Крейндлин, Э., Паринов, С., Мологина, Н., и Мирзабеков А., Диагностика генетических мутаций на олигонуклеотидных микрочипах. (1997 г.) Мол. Биол., 31, с. 159-167.
5. «Биочипы в биологии и медицине XXI века» Академик А.Д. Мирзабеков. Выступление на научной сессии общего собрания РАН
6. Барский В., Колчинский А., Лысов Ю., Мирзабеков А. Биологические микрочипы, содержащие иммобилизованные в гидрогеле нуклеиновые кислоты, белки и другие соединения: свойства и приложения в геномике // Мол. биол., 2002. Т. 36. С. 563-584.
7. Новейшие технологии в генодиагностике: полимеразная цепная реакция в реальном времени (Real-Time PCR). Екимов А.Н., Шипулин Г.А., Бочкарев Е.Г. Рюмин Д.В. Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии Министерства Здравоохранения РФ.
8. Л. И. Патрушев «Искусственные генетические системы» Том 1 Москва, Наука, 2004 С.228.
9. Момыналиев К.Т., Говорун В.М. «Методы развития ДНК-диагностики в клининеческой медицине» Лаборатория генной инженерии и иммуногенетики НИИ физико-химической медицины МЗ РФ, Москва 2003
10. Ekins R.P. (1987) An overview of present and future ultrasensitive nonisotopic immunoassay development. Clin. Biochem. Revs. 8, 12-22.
11. Bernard P.S., Pritham G.H., Wittwer C.T. Color multiplexing hybridization probes using the apolipoprotein E locus as a model system for genotyping. //Analytycal Biochemistry.-1999. - № 273.- p. 221-228.
12. Coutlee, F., He Y., Saint-Antoine P., Olivier C. , Kessous A. Coamplification of HIV type 1 and beta-globin gene DNA sequences in a nonisotopic polimerase chain reaction assay to control for amplification efficiency.// AIDS Res. Hum. Retroviruses.-1995.-№ 11.- p.363-371
14. Higuchi R. Kinetic PCR Analysis: Real-time monitoring of DNA amplification reactions// Biotechnology.-1993.-№ 11.- 1026-1030.
15. Sykes P.J., Neoh S.H., Brisco M.J., Hughes E., Condon J., Morley А.А. Quantitation of targets for PCR by use of limiting dilution.// BioTechniques.-1995.-№ 13.- p.444-449.
16. Tyagi S., Kramer F.R. Molecular beacons: probes that fluoresce upon hybridization.// Nat Biotechnol.-1996.-№ 14.- p.303-308.
17. Timofeev E., Mirzabekov A. (1998) Immobilization of DNA in polyacrylamide gel for the manifacture of DNA and DNA-oligonucleotide microchips and protein microchips. Anal.Biochem., 259, 34-41.
18. Adessi C., Matton G., Ayala G., Turcatti G., Mermod J., Mayer P. , Kawashima E. Solid phase DNA amрlification: characterisation of primer attachment and amplification mechanism //Nucleic Acids Research. – 2000. - Vol. 51. - No. 20.
19. Bing D., Boles C., Rehman F., Audeh M., Belmarsh M., Kelley B., Adams C.. Bridge amplification: a solid phase PCR system for the amplification and detection of allelic differences in single copy genes //Genetic Identity Conference Proceedings, Seventh International Symposium on Human Identification. - 1996.
20. Brookes A., Lehvaslaiho H., Siegfried M., Boehm J., Yuan Y., Sarkar C., Bork P., Ortigao F. HGBASE: a database of SNPs and other variations in and around human genes //Nucleic Acids Res. – 2000. – Vol. 28. - № 1- pp. 356-60.
21. Mercier J., Slater G. Solid Phase DNA Amplification: A Brownian Dynamics Study of Crowding Effects //Biophysical Journal.- 2005. – Vol. 89.
2019-12-29
189
Обсуждений (0)
