Определение зависимости сигнала флуоресценции от концентрации ДНК
Готовили разведение матрицы с концентрациями 7, 3.5, 1.75, 0.875 и 0.219 нг. К растворам ДНК добавляли одинаковое количество красителя SYBRgreen согласно протоколу описанному в пункте 2.3.1. Образцы объемом 1 мкл помещали в лунки планшетов. Измерение и регистрацию флуоресцентного сигнала проводили с помощью описанной системы детекции и программы «Qwantа». Результаты измерений представлены в таблице 2 и рис. 16.
Таблица 2
Концентрация ДНК (нг)
Флуоресцентный сигнал (у.е.)
Измерение
Отклонение
7
180
+/-15
3,5
170
+/-13
1,75
142
+/-11
0,875
63
+/-7
0,437
41
+/-4
0,219
21
+/-2
0
17
+/-2
На графике (рис. 16) видно, что зависимость сигнала флуоресценции от концентрации ДНК имеет некую кривую. Разброс значений по мере роста концентрации ДНК увеличивается.
Рис 16. График зависимости флуоресцентного сигнала от концентрации ДНК.
Проведение ПЦР в разных объемах смеси в пробирках
Перед проведением реакции в микроплашках ПЦР провели в пробирках Eppendorf с общим объемом смеси 5, 4, 3, 2 и 1 мкл (исходная концентрация ДНК – 7 нг) в среде масла. Подобная модель миниатюризации реакции может дать ответ на вопрос в каком минимальном объеме возможно прохождение амплификации и насколько эффективно. Данные о приросте сигнала флуоресценции будут своеобразным контролем для реакции смеси соответствующего объема в изготовленных микропланшетах.
ПЦР-смесь заливали минеральным маслом объемом 10 мкл. В результате получали капельки образца в среде масла (рис. 17 А).
Рис. 17. Пробирки с разным объемом ПЦР смеси в среде минерального масла. А – схематическое изображение. Б – реальное изображение капли в объективе камеры.
В качестве контроля служила смесь без матрицы в соответствующих объемах. Амплификацию проводили в амплификаторе «Терцик» производства «ДНК-технология». Реакцию ставили с использованием зондов SYBRgreen и TaqMan по протоколам описанным в пункте 2.3.2 и 2.3.3 соответственно. После амплификации из каждой пробы отбирали по 1 мкл на измерения в стрипах. Тем самым измеряли флуоресценцию в одинаковых объемах. По результатам этих измерений судили об эффективности амплификации в каждой капле. Результаты детектировали на описанном выше оборудовании в пробирках и в перенесенных в микропланшетах (объем анализируемой смеси одинаков во всех пяти случаях – 1 мкл) (рис. 18.).
А Б
Рис 18. Лунка микропланшета с образцом объемом 1 мкл. А – в разрезе, Б – вид в объектив камеры (фотография).
Результаты измерений представлены в таблицах 2 и 3.
Таблица 2.
Объем смеси
(мкл)
Образцы с матрицей
(у.е. флуоресценции)
Образцы без матрицы
(у.е. флуоресценции)
Приращение сигнала
(у.е. флуоресценции)
Образцы с матрицей(у.е. флуоресценции)
Образцы без матрицы (у.е. флуоресценции)
Приращение сигнала
(у.е. флуоресценции)
в микропробирках
в объеме 1 мкл в пластиковых микрострипах
1
130,43
119,12
11,31
59,44
31,38
28,06
2
129,82
111,55
18,25
50,89
44,01
6,88
3
176,10
150,34
25,76
63,01
59,86
3,14
4
162,77
155,13
7,64
65,70
55,88
9,82
5
161,55
149,38
12,17
70,00
52,70
17,30
Таблица 3.
Объем смеси
(мкл)
Образцы с матрицей
(у.е. флуоресценци)
Образцы без матрицы
(у.е. флуоресценции)
Приращение сигнала
(у.е. флуоресценции)
Образцы с матрицей (у.е. флуоресценции)
Образцы без матрицы(у.ефлуоресценции)
Приращение сигнала
(у.е. флуоресценции)
в микропробирках
в объеме 1мкл в пластиковых микрострипах
1
218,43
199,52
18,91
98,48
78,61
19,87
2
226,78
202,54
24,24
90,61
81,81
8,80
3
187,78
156,85
30,93
92,38
76,21
16,17
4
199,48
166,48
33,01
112,30
97,60
14,70
5
215,14
186,65
28,49
–
65,43
–
По результатам видно, что амплификация прошла во всех пробах, так как во всех случаях число, означающее приращение флуоресцентного сигнала, является положительным. Если обратить внимание на приращение сигнала в образцах измеряемых в микрострипах и сравнить с друг с другом, можно сделать вывод, что амплификация в одном мкл прошла не менее эффективно, чем в остальных объемах. Следующий этап работы – это проведение реакции в пластиковых микропланшетах в объеме смеси 1 мкл.
3.3. Проведение ПЦР реакции в пластиковых микропланшетах
ПЦР проводили по вышеописанному протоколу (используя кит) на планшете с 25 лунками. ПЦР смесь добавляли в лунки объемом 1 мкл. Использовалось 2 вида контрольных проб. Первый контроль – это пцр смесь без матрицы. Второй контроль – это водный раствор SYBRgreen той же концентрации что и в пцр смеси. Схема эксперимента представлена на рис. 19. Измерение и регистрацию флуоресцентного сигнала проводили с помощью описанной системы детекции и программы «Qwantа».
Рис. 19. Схема нанесения проб в лунки планшета.
Рис. 20. Результат амплификации в пластиковых микропланшетах.
По результатам эксперимента (рис. 20) видно что в 1 и 3 ряду амплификация прошла, так как интенсивность флуоресценции заметно возросла. Темное пятнышко по центру лунок – это некоторый объем воздуха который образуется при покрытии плашки пленкой. Это указывает на то, что практически весь объем лунки заполнен образцом.
В этих же рядах в лунках под номером 5 сигнал значения не изменил. Это доказывает то, что матрица здесь не присутствовала. Контроль номер 2 также сработал, так как флуоресценция в 4 ряду свое значение не изменила. Второй и пятый ряды практически не флуоресцируют. Это подтверждает наличие в их лунках воды. Значения сигнала флуоресценции каждой лунки представлены в таблице 4. Графическое изображение полученной картины представлено на рис. 21.
1 столбец
2 столбец
3 столбец
4 столбец
5 столбец
1 ряд
49,82
73,54
84,25
83,68
38,91
2 ряд
17,61
35,76
34,41
31,66
24,56
3 ряд
72,26
92,30
117,95
113,88
41,02
4 ряд
26,88
34,04
40,36
43,36
40,88
5 ряд
10,34
12,81
17,81
20,89
19,08
Таблица 4
Рис. 21. Диаграмма, отображающая уровень сигнала в лунках пластиковой микроплашки.
2019-12-29
203
Обсуждений (0)
А 
Б
