ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Приборы и материалы

Спектры ЯМР ¹Н полученных веществ записывали на приборе TESLA BS 587A (рабочая частота 80 МГц) и Bruker АМ-300 (рабочая частота 300 МГц) в дейтерохлороформе.

В качестве сырья для получения производных хлорофилла использовали высушенную измельченную спирулину.

Для проведения колоночной и тонкослойной хроматографии использовали четыреххлористый углерод марки “ч”, ацетон марки “ч”. Для приготовления элюентов соотношение растворителей брали по объему. При проведении колоночной хроматографии, колонку наполняли “мокрым способом”, используя четыреххлористый углерод.

Для экстракции производных хлорофилла из спирулины использовали 95%-ый этанол марки “ч” без дополнительной очистки.

Для осаждения феофитинов использовали разбавленную водой соляную кислоту квалификации “ч” в соотношении 1:9 (по объему). Концентрированную соляную кислоту использовали в реакциях гидролиза.

Для обработки реакционных смесей, нанесения веществ на колонку и пластинки для проведения тонкослойной хроматографии (ТСХ), а также в качестве растворителя использовали хлороформ квалификации “ч”, без предварительной очистки, а так же хлористый метилен.

Безводный сульфат натрия, квалификации “х.ч.” использовали для удаления остатков воды из растворов в органических растворителях (при обработке реакционных смесей).

Ацетон, марки «ч» без дополнительной очистки использовался для колоночной и тонкослойной хроматографии.

Серная кислота квалификации «х.ч.» использовалась для обработки бензола.

Бензол, обработанный серной кислотой и перегнанный при температуре 80,05 - 80,15⁰С.

Уксусная кислота марки «ч.» использовались для проведения реакций Даффа.

Колоночную хроматографию проводили на силикагеле L 100/400 и оксиде алюминия.

Метанол использовался при синтезе метилфеофорбида (а) и метилового эфира13(2)-метоксифеофорбида (а).

Уротропин использовался в реакциях Даффа, для получения катион <http://www.chemport.ru/chemical_encyclopedia_article_1607.html> формалъдимина CH₂=NH₂⁺(электрофильного агента).

Хроматографическое исследование синтезированных соединений

Метод ТСХ. Контроль за процессами выделения, разделения и превращениями производных хлорофилла при помощи ТСХ проводили на пластинках Silufol и Sorbifol. В качестве элюентов использовали смеси ССI₄ с ацетоном в соотношениях 4:1 (по обьему).

Для сравнения хроматографической подвижности в условиях тонкослойной хроматографии использовали метод свидетеля. Для этого исследуемая смесь и эталонный образец хроматографировали на одной и той же пластинке, совпадения значений R_f при близких концентрациях исследуемого пигмента и “свидетеля” означает хроматографическую идентичность этих соединений в данной хроматографической системе.

2.3 Получение метилфеофорбида (а)

Типичная методика: 500 г сухой мелко измельченной спирулины экстрагировали в 1 дм³ этанола. Полученный экстракт упаривали при пониженном давлении и подкисляли 0,1 н. соляной кислотой. Выпавшие в осадок феофетины отфильтровывали, промывали водой, этанолом и высушивали. Феофитины идентифицировали с помощью ТСХ (Silufol, СС1₄ : ацетон - 4:1).

Высушенные 0,6 г феофитинов растворяли в смеси 28 см³ метанола и 1,4 см³ концентрированной серной кислоты. Смесь кипятили в течение 1 часа с обратным холодильником. Далее реакционную смесь разбавляли 30 см³ хлороформа и водой отмывали метанол и серную кислоту до рН промывных вод. Смесь сушили над безводным сульфатом натрия. Раствор упаривали досуха на роторе. Затем остаток после упаривания хроматографировали на силикагеле (нанесение из 3 см³ хлороформа, элюирование смесью ССl₄: ацетон в соотношениях от 60:1 до 40:1). За ходом разделения следили при помощи TCX (Silufol, СС1₄ : ацетон - 4:1). Фракцию, содержащую основное вещество, упарили и получили 0,4 г метилфеофорбида (а).

2.3.1 Выделение метилового эфира 13(2)-гидроксифеофорбида (а)

13(2)-гидроксифеофорбид (а) выделяли из смеси с феофорбидом (а) и других производных хлорофилла методом колоночной хроматографии на силикагеле. Смесь 13(2)-гироксифеофорбида (а) и феофорбида (а) элюировали смесью ССI₄: ацетон в соотношении от 80:1 до 60:1. Фракцию содержащую 13(2)-гидроксифеофорбида (а) упарили. Вещество после упаривания пере­осаждали из хлороформа гексаном. Получили 0,2 мг 13(2)-гидроксифеофорбида (а).

Таблица 1 Положение сигналов спектров ЯМР ¹Н метилфеофорбида а, 13(2)-гидроксифеофорбида а, метилфеофорбида а (литературные данные)

Реакция Даффа

Растворили 0,4 г сухого метилфеофорбида (а) в смеси 10 см³ уксусной кислоты и 0,3 г уротропина. Полученную смесь оставили при комнатной температуре на некоторое время, для инициирования катиона формальдимина с последующим присоединением к субстрату. Каждый час извлекали пробу на ТСХ(Silufol, СС1₄: ацетон - 4:1), контролирую тем самым ход реакции. По прохождению реакции смеси дали остыть и разбавляли 30 см³ хлороформа и водой отмывали уксусную кислоту до рН промывных вод. Смесь сушили над безводным сульфатом натрия. Раствор упаривали досуха на роторе. Затем остаток после упаривания хроматографировали на силикагеле (нанесение из 3 см³ хлороформа, элюирование смесью ССl₄: ацетон в соотношениях от 60:1 до 40:1). За ходом разделения следили при помощи TCX (Silufol, СС1₄: ацетон - 4:1). Фракцию, содержащую основное вещество, упарили и получили 0,1 г метилфеофорбидакетона.