Аппаратурное оснащение

Один из популярных современных приборов для проведения рецепторного анализа: Многофункциональный планшетный анализатор VICTOR серии X - продолжение известной серии надежных и простых в работе планшетных анализаторов. VICTOR 3 TM от компании PerkinElmer. Наряду с обновленным дизайном VICTOR X имеет ряд новых конструктивных решений для более удобного использования: прямая оптическая система с более высокой чувствительностью и рабочим диапазоном для всех используемых технологий, более удобный модуль загрузки, использование 1-1536-луночных планшет SBS-формата, а также чашек Петри, слайдов, фильтров, ПЦР и Терасаки планшет. Планшеты могут загружаться в анализатор вручную, или со стэкеров на 20 или 40 планшет. Анализаторы VICTOR X могут работать как самостоятельно, так и в составе многофункциональных роботизированных комплексов [3].

МЕТОДЫ ДЕТЕКЦИИ

Флюоресценция (340-850 нм).

Измерение соотношения флюоресценции на двух длинах волн.

Измерение флюоресценции снизу и сверху планшеты.

Поляризационная флюоресценция (400-850 нм) Флюоресценция, отсроченная по времени (TRF).

Двухоконная TRF.

Измерение эмиссии на двух длинах волн.

Люминесценция.

Постоянная люминесценция (Glow).

Импульсная люминесценция (Flash).

Двойная (комбинированная) люминесценция.

Фотометрия в видимой области (340-1000 нм) УФ-фотометрия (260/280 нм).

ПРИМЕНЕНИЕ

Клеточная биология и цитология.

Иммуноферментный и рецепторный анализы.

Токсикология.

Мониторинг продуктов питания.

Кинетика.

Молекулярная биология.

Количественный анализ (белки, ssDNA, dsDNA, клетки, бактерии и др.).

Скрининг лекарственных препаратов и метаболитов.

Сенсоры

. Общая характеристика.

Рабочей частью аналитической аппаратуры для рецепторного анализа являются биосенсоры. Химические (биологические) сенсоры - это тип аналитических устройств, которые служат для качественного и количественного определения химических (биологических) веществ. Обычно сенсор состоит из следующих частей:

Распознающий элемент (он также может быть назван рецепторным слоем) представляет собой вещество, которое способно селективно взаимодействовать с аналитом.

Трансдьюсер (англ. Transducer - преобразователь, датчик) преобразует химическое или биологическое взаимодействие в электрический сигнал.

Система сбора и обработки данных служит для усиления и анализа сигнала и отображения результатов.

Биологические сенсоры отличаются от химических только тем, что они направлены на детектирование органических молекул, важных для живых организмов: высокомолекулярных, таких как белки, ДНК, и низкомолекулярных, например, глюкозы и мочевины. В данном обзоре обсуждаются основные распознающие элементы биологических сенсоров; как и в химических сенсорах, основное предъявляемое к ним требование - способность улавливать определенный аналит и не реагировать на посторонние вещества, присутствующие в образце [5].

Необходимо отметить, что разработка сенсоров является междисциплинарной задачей, которая требует участия широкого круга специалистов: физиков, инженеров, химиков, биологов, врачей, экологов. Кроме очевидных требований, предъявляемых к новым сенсорам, таких как простота эксплуатации, дешевизна, высокая точность, селективность и скорость анализа, добавляются еще требования миниатюризации (это связано с развитием нанотехнологий), иногда возможность работать в непрерывном режиме, а иногда даже - возможность внедрения в человеческий организм.

Используемые в биосенсорах трансдьюсеры чрезвычайно разнообразны. Возможно, наиболее часто применяются электрохимические преобразователи, в которых трансдьюсером является электрод, помещенный в исследуемый раствор. Оптические биосенсоры используют явления полного внутреннего отражения и поверхностного плазмонного резонанса. Гравиметрические сенсоры используют изменение массы при связывании аналита, они обычно основаны на акустических волнах или пьезокварцевых микровесах. Для ознакомления с типами трансдьюсеров авторы рекомендуют обратиться к обзорам.

. Характеристики биосенсоров.

В данном разделе описаны параметры и характеристики биосенсоров как аналитических приборов. Все они используются и для описания химических сенсоров, которые чрезвычайно близки к биологическим по принципам действия и технической реализации.

Как и любой научный прибор, каждый сенсор имеет допустимый диапазон температур, давлений и pH. Кроме того, каждый сенсор, который не только констатирует наличие аналита, но и измеряет его концентрацию, очевидно, характеризуется такими параметрами, как точность и воспроизводимость. Также важны такие параметры, как рабочий диапазон (тот диапазон концентраций, в котором работает метод измерений) и линейный диапазон. Для их определения требуется построить калибровочную кривую - зависимость величины сигнала от концентрации аналита, ее линейный участок называется линейным диапазоном. В некоторых типах сенсоров (например, в потенциометрических) величина сигнала пропорциональна логарифму концентрации [5].

Чувствительность сенсора показывает отношение сигнала, выраженного, например, в вольтах, к концентрации аналита, которая вызвала этот сигнал. Более строго чувствительность определяется как максимальное значение производной величины отклика по концентрации. Следует отличать чувствительность от предела обнаружения (detection limit) - той минимальной концентрации аналита (или минимального количества вещества), которая может быть детектирована и измерена. Для современных сенсоров это значение может быть чрезвычайно малым. Так, например, в работе обсуждаются иммунологические сенсоры с пределом обнаружения 10-21 моль. Описана резонансная система нанометровых размеров, способная зарегистрировать 1 аттограмм (10-18 г) вещества, основанная на пьезорезистивном эффекте.

Важнейшей характеристикой сенсора является селективность, она отражает способность детектировать определенный аналит и не реагировать на посторонние вещества. Для количественного определения селективности используются два основных метода. Первый предполагает построение калибровочных кривых не только для аналита, но и для посторонних примесей при одинаковых условиях эксперимента. В этом случае селективность выражается как отношение величины сигнала, вызываемого аналитом к величине сигнала, вызываемой примесью той же концентрации. При другом подходе в ячейку, уже содержащую аналит, вводят примеси в тех концентрациях, которых можно ожидать в реальных образцах, и выражают селективность как изменение сигнала в процентах. Второй метод дает более наглядное и практически удобное значение селективности, но он является более субъективным, т.к. зависит от диапазона концентраций, в котором производятся измерения [5].

К временным характеристикам сенсоров относятся следующие: время отклика, время жизни и время регенерации. Время отклика необходимо для возникновения равновесия между анализируемым образцом и рецепторным слоем. Хотя оно должно быть сведено к минимуму, в некоторых методах, оно составляет порядка нескольких часов. Время жизни - это срок воспроизводимой работы сенсора, он ограничен деградацией рецепторного слоя. Иногда (например, в коммерческих сенсорах для определения глюкозы) используются одноразовые распознающие элементы. Время регенерации это время, которое требуется для восстановления работоспособности распознающего элемента. В заключение скажем, что для непрерывного монитринга часто требуется изготавливать сенсоры с проточными ячейками или зондами, которые вносятся в поток анализируемого вещества. Такие сенсоры особенно важны для контроля на производстве и мониторинга окружающей среды, их проектирование представляет собой сложную инженерно-техническую работу.

. Распознающие элементы.

Выше было сказано, что одной из основных характеристик биосенсоров является селективность. Обычно (хотя не всегда) селективность определяется свойствами распознающего элемента. Ниже рассматриваются основные типы рецепторных слоев и их особенности.

Наиболее часто распознающими элементами биосенсоров являются ферменты - высокоспецифичные катализаторы биохимических реакций. В состав фермента входит одна или несколько белковых молекул, иногда присутствует небелковая часть. Каталитическая активность ферментов значительно выше, чем у любых искусственных катализаторов, ферменты увеличивают скорость реакции в 103-107 раз. Классический пример биосенсора, использующего ферментативный рецепторный слой это амперометрический сенсор на глюкозу с глюкозоксидазой (GOD). Возможно, это один из самых первых биосенсоров. В нем глюкоза окисляется до глюконовой кислоты с образованием перекиси водорода:

Глюкоза+О2->глюконовая кислота+Н2О2.

В разных модификациях может регистрироваться либо уменьшение концентрации кислорода, либо увеличение концентрации перекиси. Фермент GOD является сравнительно недорогим, при правильной упаковке одноразовый распознающий элемент может храниться около 6 месяцев.

Иногда ферменты используются непосредственно в составе тканей организмов животных или растений. Например, в обсуждается сенсор на дофамин (нейрогормон, биологический предшественник адреналина), использующий ткани грибов, иммобилизованные на электроде при помощи углеродной пасты. Преимущества использования тканей вместо очищенных ферментов состоят в следующем: ткани существенно дешевле, содержащиеся в них ферменты находятся в естественном окружении, поэтому они дольше и надежнее работают. Таким образом, использование тканей в биосенсорах решает проблемы деактивации и деградации ферментов при их иммобилизации, увеличивает стабильность ферментов. При этом существенным недостатком, который ограничивает спектр возможных применений тканей, очевидно, является их низкая селективность, связанная с присутствием большого количества посторонних ферментов. Тем не менее, использование тканей в рецепторных слоях в некоторых случаях позволяет радикально снизить себестоимость биосенсоров [5].

К биосенсорам на основе тканей идеологически близки технологии с использованием клеток в качестве распознающих элементов. По мнению автора, клеточные биосенсоры наряду с ферментными занимают лидирующие позиции по степени разработки и внедрения. Необходимо отметить, что для многих клеток разработаны методы генной инженерии, позволяющие повысить выработку определенного белка и таким образом повысить эффективность работы сенсора.

В обзоре рассматриваются клеточные биосенсоры, созданные с использованием технологий генной инженерии. При проникновении внутрь клетки аналит вызывает синтез легко детектируемого белка, например, флуоресцентного белка GFP. В число достоинств таких биоиндикаторов входят следующие: способность проводить анализ с пространственным разрешением порядка размера клетки (например, для анализа химического состава почвы), возможность быстрого обнаружения токсичных веществ, возможность измерять концентрации веществ в естественной среде, а не в пробе.

Биосенсоры, использующие ферменты в рецепторном слое, иногда называют каталитическими. Существуют еще и аффинные биосенсоры (affinity biosensors), использующие антитела, нуклеиновые кислоты и рецепторы. Отличие между ними состоит в следующем. В ферментативных сенсорах происходит реакция по общей схеме

Субстрат (S) связывается с ферментом (E), образуя комплекс ES, затем субстрат превращается в продукт (P) и высвобождается. Эта реакция описывается кинетикой Михаеэлиса-Мэттен. В случае аффинных биосенсоров в рецепторном слое происходит реакция вида

В таких реакциях не образуется новых продуктов, происходит связывание молекул А и В в комплекс АВ. Реакции этого типа также называют реакциями непродуктивного связывания. В общем случае это приводит к ужесточению требований, предъявляемых к трансдьюсеру, т.к. акт связывания сложнее зарегистрировать. К аффинным биосенсорам относятся сенсоры на ДНК, на антигены и антитела и сенсоры с использованием рецепторов.

Детектирование молекул ДНК основано на взаимодействии между комплементарными цепями. Природа этого взаимодействия - водородные связи между парами нуклеотидов. В ДНК-сенсорах рецепторный слой состоит из иммобилизованных одноцепочечных ДНК, которые улавливают из раствора комплементарные цепи. Hекордно предел обнаружения ДНК был достигнут с использованием метода электрохимической хемилюминесценции и составил 10 аМ (10-18 М) [5].

Приготовление образцов ДНК для исследований является сложным и трудоемким процессом. После очистки пробы для увеличения количества молекул ДНК определенного типа используется процедура полимеразно-цепной реакции (ПЦР). Развитие ДНК-биосенсоров позволит обходиться без специальных методов выделения ДНК из образца и ПЦР, и детектировать отдельные цепи в течение часа. В последние годы была создана технология ДНК-биочипов, которая позволяет вести анализ большого числа генов одновременно. Развитие ДНК-биосенсоров представляется крайне важным т.к., оно поможет в обнаружении патогенных микроорганизмов, мутаций, диагностике наследственных заболеваний, и во многих других областях. Необходимо отметить развитие методов анализа ДНК с целью идентификации личности.

Антитела - это сложные белковые молекулы, построенные из нескольких субъединиц, вырабатывающиеся в организмах позвоночных в ответ на проникновение чужеродных агентов (антигенов), например, токсинов, вирусов или чуждых организму макромолекул. Циркулирующие в крови антитела связываются с антигенами, деактивируют их и выводятся из организма. Кроме того, связанные антитела служат метками для микроорганизмов, подлежащих уничтожению. Взаимодействие антиген - антитело считается наиболее селективным для применения в биосенсорах. С точки зрения физики, это взаимодействие осуществляется теми же по природе силами, что и взаимодействие фермента с субстратом: вандерваальсовыми силами, ионными, гидрофобными и гидрофильными взаимодействиями, водородными связями. Сложность применения антител в биосенсорах состоит в том, что акт связывания антигена часто тяжело зарегистрировать. Это является общим недостатком аффинных биосенсоров и требует применения специальных методов, например, использования меток. Другая сложность состоит в том, что аффинные взаимодействия часто имеют высокие значения константы ассоциации, т.е. слабо обратимы, и использующие их распознающие элементы часто являются одноразовыми или требуют специальных методов регенерации. Например, для разрушения связи антиген-антитело иногда используются 10-100 мМ HCl или глициновый буфер pH 1.7-2.2 [5].

Рецепторы - это мембранные белки, способные связывать определенные лиганды и вызывать определенный физиологический отклик в ответ на акт связывания. Рецепторы обычно используются в биосенсорах в составе клеток, так как в очищенном виде они недостаточно стабильны. Биосенсоры на основе рецепторов не получили широкого распространения. В работе для изучения активности фермента одновременно использовались методы регистрации аффинного взаимодействия и каталитической реакции. Белок бета-лактамаза, который иногда ответственен за устойчивость бактерий к антибиотикам, был иммобилизован на поверхности, кинетика образования монослоя контролировалась методом поверхностного плазмонного резонанса. Далее в систему вводился субстрат - нитроцефин, который под действием бета-лактамаз гидролизовался с образованием окрашенного продукта. Он регистрировался спектроскопически по изменению спектра поглощения. В аффинных биосенсорах часто используется метод меток и конкурирующего связывания. Для анализа образца в сенсор специально вводится некоторое количество меченого аналита. Метки могут быть различной природы, например, флуоресцентные или радиоактивные. Связывание меченого аналита, содержащегося в растворе в малой концентрации, очень чувствительно к концентрации немеченого аналита, которую требуется измерить. Между мечеными и немечеными молекулами аналита возникает конкуренция за связывание с рецепторным слоем. После того как в системе устанавливается равновесие, требуется измерить количество связанных и свободных меток и вычислить концентрацию аналита. Классический пример использования радиоактивных меток - радиоиммунологический анализ. В нем используется конкуренция между мечеными и немечеными антигенами за связывание с антителами. Флуоресцентные метки часто используются в биосенсорах с оптическими трансдьюсерами. В иммуноферментном анализе метками являются ферменты, которые ковалентно пришиваются к антигенам или антителам, они обнаруживаются при добавлении в систему субстрата.

Достоинства и недостатки использования меток в сенсорных технологиях: прямые методы измерений, не использующие меток, часто работают быстрее и с большей точностью, чем косвенные. Введение меток в ряде случаев приводит к ухудшению связывания за счет возникновения стерических ограничений или нестабильностью меток. В то же время, при отсутствии меток требуется использовать дорогостоящее оборудование для регистрации актов связывания [5].