Флуоресцентный рецепторный анализ

До сих пор среди методов рецепторного анализа радиорецепторный анализ был краеугольным камнем всех методик. Однако в последнее время на первые позиции выходит флуоресцентный рецепторный анализ, так как он более безопасен, дешев и прост, а также показывает не менее высокую чувствительность.

На рисунке 1 изображены различные методы рецепторного анализа. (а) радиоактивный рецепторный анализ в гетерогенном формате, со стадиями отмывки комплекса от несвязавшихся лигандов. Аналитический шум обусловлен неспецифически связавшимися лигандами. (b) флуоресцентный рецепторный анализ, представленный подобно радиоактивному анализу. Аналитический шум возникает из-за аутофлуоресцирующих компонентов и неспецифически связавшихся лигандов. (с) поляризационный рецепторный анализ, представленный в однородном формате: несвязанные лиганды не удаляются, однако только связавшиеся меченные лиганды излучают поляризованную флуоресценцию; (d) однородный FRET-анализ, в котором только специфично связанные флуоресцентные лиганды принимают участие в FRET, следовательно, возрастает отношение сигнала к шуму[2].

Рисунок 1

гомогенизата сцинтилляция инкубация рецепторный

Прямое измерение интенсивности флуоресценции связанных лигандов

Этот подход, возможно, самый простой и состоит в измерении интенсивности флуоресценции связанной фракции лигандов после отделения свободной фракции. Чувствительность этого метода может быть поставлена под сомнение ввиду аутофлуоресценции многих биологических молекул.

Флуоресцентный поляризационный анализ

Этот метод анализа может быть использован для измерения более избирательно количества связавшихся флуоресцентных лигандов. Такие методики основаны на возбуждении биологических молекул поляризованным светом. Вынужденные флуорофоры будут излучать сильно поляризованную флуоресценцию. С другой стороны, свободные флуорофоры, которые могут легко вращаться в течение короткого периода между их возбуждением и излучением флуоресценции, будут противостоять этой поляризации. Таким образом, когда молекула возбуждается поляризованным светом, флуоресцентный лиганд свободно диффундирует с определенной молекулярной подвижностью и излучает неполяризованную флуоресценцию, тогда как у связанного лиганда подобной подвижности нет, и поляризованная флуоресценция будет регистрироваться и приведет к картине высокой флуоресцентной анизотропии.

В этом методе уже не требуется отмывать комплекс от несвязанных лигандов. Однако, сродство флуоресцентных лигандов к рецепторам должно быть достаточно высоким для того, чтобы отношение связанный лиганд-свободный лиганд позволяло достичь приемлемой величины сигнала.

Однако несмотря на хорошую воспроизводимость, все равно существует фактор неспецифического связывани ялигшандов и аутофлуоресценции, при этом положительный сигнал мало отличается от отрицательного, что делает методику непригодной для широкого использования [2].анализ

Как было упомянуто выше, чувствительность рецепторного анализа сильно зависит от неспецифического связывания, которое будет уменьшать отношение сигнал-шум и, следовательно, величину аналитического окна, что ведет к менее достоверному и воспроизводимому результату. Недостаток избирательности (но не сродства) лиганда может быть вредной для связывания лиганда с интересующим нас рецептором. Действительно, радиоактивный и флуоресцентный или поляризационный методы не могут выделить различие между специфическим связыванием лиганда на двух разных рецепторах.

Для решения этой проблемы создан метод, основанный на флуоресцентной резонансной передаче энергии (fluorescence resonance energy transfer - FRET). FRET происходит между «донором» флуорофора и «акцептором» флуорофора, который переносится как лигандом, так и рецептором. Существуют три параметра условий эффективности FRET: 1. Два флуорофора должны иметь способность выделять энергию; 2. Дипольный момент флуорофоров должен быть правильно ориентирован, FRET будет неэффективным, если диполи перпендикулярны, и максимален, если они параллельны; 3. Флуорофоры должны быть достаточно близко, на расстоянии примерно 10 нм.

Но самым важным параметром для FRET является все-таки энергетическая совместимость рецептора и лиганда. Излучательный спектр донора должен превышать спектр акцептора, и величина этого разрыва прямо влияет на эффективность FRET. Однако поиск большого разрыва часто связан с незначительным разделением между спектром возбуждения донора и акцептора и между их эмиссионными спектрами [2].

Чтобы увеличить чувствительность FRET подхода, разработан новый метод, в котором лантаниды осуществляют функцию донора флуорофоров. Тогда как классические флуорофоры имеют длительность жизни около нескольких наносекунд, лантаниды характеризуются намного более длительной флуоресценцией, от нескольких сотен микросекунд до нескольких миллисекунд. Это привело к созданию время-зависимой FRET (time resolved - TR FRET), методике, в которой донор флуорофора возбуждается лазером или вспышкой перед измерением излучаемого сигнала. Еще одно преимущество лантанидов - то, что они возбуждаются светом в ближней УФ области спектра и имеют большой Стоксов сдвиг [2].