Применение рецепторного анализа

Данные о рецепторном анализе скептически воспринимаются клиницистами, исходя из той точки зрения, что подобные данные ничего не говорят о функции. Да, рецепторный анализ посвящен исключительно применению в фармакологии. Он демонстрирует существование рецепторов на молекулярном уровне. Метод посвящен выделению и очистке белков и позволил выделить первый рецепторный ген. Это позволило изучить локализацию рецепторов на анатомическом и клеточном уровне и дикамику рецепторного взаимодействия, включая такие аспекты, как десенситизация рецепторов, рецепторы эндо- и экзоцитоза, транспорт рецепторов через аксоны.

В области открытия и изучения новых лекарственных средств, рецепторный анализ стал революционным открытием. Поиск лекарственных средств с использованием рецепторного взаимодействия начался в середине 1970х и вскоре привел к созданию автоматизированного рецепторного анализа, позволяющего изучить влияние тысяч соединений одновременно на многие рецепторы с минимальным участием персонала [4].

Рецепторный анализ показал, что многие лекарственный средства, уже длительно применяемые в клинической практике, взаимодействуют не с одним, а со многими рецепторами, что может вызывать определенные побочные эффекты.

Рецепторный анализ дает возможность выбрать между конкурирующими гипотезами о селективном или многоцелевом действии лекарственных средств.

Описан ряд клинических состояний, при которых нарушается взаимодействие между гормоном и его специфическим рецептором. Такие нарушения объясняют изменением числа рецепторов или их сродства к гормону, а также спонтанным образованием антител к гормональным рецепторам. У больных с атаксией-телеангиэктазией может отмечаться резкая инсулинорезистентность вследствие выраженного уменьшения сродства рецепторов к инсулину. У некоторых больных со злокачественной миастенией образуются антитела к экзогенным рецепторам ацетилхолина, что и обусловливает развитие соответствующего клинического синдрома. Подобно этому у больных с acanthosis nigricans клинически выявляется инсулинорезистентность, причем результаты обследования таких больных убедительно свидетельствуют о роли антител к инсулиновым рецепторам в имеющейся инсулинорезистентности. Число специфических рецепторов инсулина, приходящееся на каждую клетку, может быть снижено при ожирении, вследствие чего у тучных больных уменьшается чувствительность к инсулину. При уменьшении массы тела у этих больных число инсулиновых рецепторов на клетку увеличивается и нормализуется чувствительность к инсулину. У некоторых больных с гипертиреозом в крови присутствуют антитела к рецепторам ТТГ. В отличие от больных со злокачественной миастенией и диабетом, у таких больных антитела к рецепторам ТТГ могут стимулировать мембранные рецепторы в ткани щитовидной железы, индуцируя повышенную продукцию и секрецию тироксина и трийодтиронина, что и обусловливает гипертиреоидное состояние [7].

Принцип радиорецепторного метода по существу не отличается от радиоиммунологического, только гормон, вместо того чтобы связываться с антителами, связывается со специфическим гормональным рецептором плазматической мембраны или цитозоля. Специфические рецепторы большинства полипептидных гормонов располагаются на наружной поверхности плазматической мембраны клеток, тогда как рецепторы биологически активных стероидов, а также тироксина и трийодтиронина - в цитозоле и ядрах. Чувствительность радиорецепторного анализа ниже, чем радиоиммунологического и большинства биологических методов в системах in vitro. Для того чтобы взаимодействовать со своим рецептором, гормон должен иметь соответствующую конформацию, т. е. быть биологически активным. Возможна ситуация, в которой гормон теряет способность связываться со своим рецептором, но продолжает взаимодействовать с антителами в системе для радиоиммунологического анализа. Это расхождение отражает тот факт, что антитела и рецепторы «узнают» разные участки молекулы гормона.

Предложен ряд радиорецепторных методов гормонального анализа. Обычно получают ткань специфического для данного гормона органа-мишени и с помощью стандартных методик выделяют из нее рецепторы. Изолированные рецепторы плазматической мембраны в осадке при хранении в условиях температуры менее -20 °С относительно стабильны. Однако солюбилизированные рецепторы полипептидных и стероидных гормонов, выделенные из плазматических мембран либо из цитозоля и не связанные с лигандами, оказываются нестабильными, что проявляется снижением их способности связывать специфические гормоны, даже если они хранились в замороженном виде, сравнительно недолго [9].

Как пример использования рецепторных методов анализа в современной клинической фармакологии в качестве методики обнаружения лекарственного средства можно привести исследование фармакодинамики фенотропила [10]. Для количественного определения рецепторов в мембранных препаратах, приготовленных из компетентных морфофункциональных образований (гиппокампа, полосатого тела, коры больших полушарий) мозга крыс, применяли общепринятый метод радиорецепторного анализа с использованием специфических лигандов, меченных по тритию, в подборе которых основывались на рекомендациях IUPHAR от 2006 г. Были использованы два методических подхода в действии Фенотропила на рецепторы нейромедиаторов: метод in vitro и метод ex vivo. В первом случае мембраны мозга, содержащие рецепторы, инкубировали в пробирках вместе с радиоактивно меченным лигандом определенного рецептора в присутствии различных концентраций Фенотропила. Измерение специфически связавшегося в данных условиях радиоактивного лиганда с мембранным рецептором давало ответ на вопрос: оказывает ли лекарственное вещество прямое, конкурирующее действие на изучаемый тип рецептора? Активность препарата в данном варианте опытов выражали величиной концентрации, изменяющей специфическое связывание радиоактивного лиганда с рецептором на 50%, - IC50 (“inhibitory concentration 50”). Во втором случае Фенотропил вводили крысам внутрибрюшинно в дозе 100 мг/кг, один раз в день в течение 7 сут. Группе контрольных животных вводили физиологический раствор. Через 24 ч после последней инъекции крыс декапитировали, извлекали мозг, готовили мембраны выделенных структур мозга, образцы которых инкубировали в присутствии радиолиганда.

Обработанные результаты измерений были представлены величинами Bmax и Kd, отражающими концентрацию рецепторов в мембранах и степень структурного сродства (аффинитета) лекарственного средства к рецептору.

соответственно. Анализ данных ex vivo позволяет интерпретировать полученные сведения в свете возможного непрямого, модулирующего влияния Фенотропила на рецепторный профиль, отражающий реакцию клеток мозга на субхроническое введение препарата. Все меченые лиганды были получены методом твердофазного катализа в ОХВАВ Института молекулярной генетики РАН (заведующий - академик РАН Н.Ф. Мясоедов). Результаты экспериментов обрабатывали с помощью программ Statistica 6.0 и GraphPad 4.0 Prism [10].

Также рецепторный анализ можно использовать для определения альбумина в моче методом гетерогенного твердофазного одностадийного конкурентного рецепторного анализа при изучении клинической фармакологии пероральных гипогликемических средств, а также многих других [8].

С учетом того, что в Российской Федерации с 2007 года существует ГОСТ, регламентирующий использование рецепторного анализа для обнаружения противомикробных средств в молоке и молочных продуктах, следует отметить широкую востребованность рецепторных методов на территории СНГ.