Методы рецепторного анализа in vitro с использованием тканей, клеточных гомогенизатов или мембранных препаратов

Ткани и препараты

Ткани, используемые для рецепторного анализа, например, ткани отделов мозга или органов, культивированные клетки (клеточные линии или первичные культуры) или кровяные клетки, которые несут исследуемый рецептор, нативный или привитый искусственно, получают от специфических видов (чаще всего человеческие). Также при подходящих условиях рецепторное связывание может быть представлено на интактных клетках, гомогенизатах тканей или мембранных препаратах. Используемые мембранные препараты являются полностью отделенной фракцией, получаемой с помощью ультрацентрифугирования или мембранным препаратом, полученным из отделенных клеточных структур (тяжелые и легкие митохондриальные фракции, фракция плазматической мембраны), с последующей осторожной гомогенизацией ткани в 0,25М сахарозе. Мембранные препараты отмываются ресуспендированием в объем и повторным центрифугированием. Все стадии получения препаратов должны проходить при температуре 0-4 оС, хранение препаратов - ниже -20оС [4].

Инкубация в пробирках и ячейковых планшетах

Инкубация проводят в пробирках объемом 0,5 -2мл или 96-ячейковых планшетах (0,1-0,2 мл). Инкубируемая смесь состоит из образцов клеток или мембранных препаратов, взвешенных в буферном растворе, аликвоты меченого лиганда, прибавленного в расчете на конечную желаемую концентрацию и, в зависимости от типа эксперимента, аликвоты конкурентного агониста. Буфер должне иметь определенную величину рН (около 7,4) и содержать необходимые добавки, например, ионы металлов. В зависимости от типа эксперимента, инкубация происходит при заданной температуре в течение заданного периода. Для исследований конкурентного связывания, время инкубации должно быть достаточным для установления равновесия.

Методы фильтрации

Меченый лиганд, проникший в тканевой препарат и свободный меченый лиганд разделяют фильтрацией на стеклянном фильтре (иногда обработанном полиэтиленимином для предотвращения адсорбции) при разрежении, далее быстро разбавляют фильтрат охлажденным буферным раствором. Радиоактивность связавшегося меченого лиганда рассчитывается с использованием фильтра; для анализа β-излучающих изотопов, например изотоп трития, фильтр высушивается, добавляется сцинтилляционная жидкость и подсчитывается радиоактивность. Для анализа γ-излучающих изотопов, например 125I, радиоактивность определяется непосредственно [4].

Анализ близкой сцинтилляции (Scintillation Proximity Assay, SPA)

SPA - гомогенный анализ, позволяющий избежать стадии фильтрования. Для SPA используются как поливинилтолуольные пузырьки, наполненные сцинтиллянтом, так и "Flashplates" или "Scintiplates", 96-ячейковые планшеты со сцинтиллянтом, защищенные инертным покрытием. Пузырьки или планшеты покрывают мембранным препаратом. Покрытые пузырьки помещают в ячейки планшета и инкубируют с меченым лигандом без или с конкурентным агонистом в необходимой концентрации в буфере. Так как ткань не находится «в свободном растворе», требуется несколько часов инкубации, чтобы достичь равновесия. После инкубации, многоячейковые планшеты помещаются прямо в Topcount NXT. Сцинтиллянт будет обнаруживать только ту радиоактивность, которая происходит в непосредственной близости от него, таким образом, меченый лиганд, связавшийся с тканью, покроет стенки пузырька или ячейки. Формат технологии mix-and-read пригоден для высокоэффективного скрининга, но следует иметь ввиду увеличенную длительность термостатирования.

Нерадиоактивный близкий анализ (Nonradioactive Proximity Assays)

Загрязнение окружающей среды и высокая стоимость обезвреживания радиоактивных отходов обусловили развитие методик нерадиоактивного анализа рецепторного связывания. TR-FRET, известная как флуоресцентный анализ, и АlphaScreen, основанный на хемилюминесценции, являются примерами широко применяемых методик в анализе конкурентного рецепторного связывания. Методики основываются на возбуждении «донорной» пробы (связанной с лигандом), которая является механизмом переноса энергии акцепторной пробе (связанной с рецепторным препаратом), если они находятся в непосредственной близости. Акцепторная проба начинает излучать свет определенной длины волны, которую обнаруживают и подсчитывают. Применение этой методики ограничено, так как она требует создания лигандов, меченных относительно большими молекулами, в результате изменяется нативная структура лиганда. Способность связываться с рецептором у таких лигандов уменьшается. Развитие таких лигандов - дело проб и ошибок [4].

Ауторадиография меченых лигандов

Ауторадиография - общая технология, позволяющая визуализировать распределение радиоактивного лиганда, связанного с молекулярной целью в срезе ткани. Радиоактивный лиганд может быть введен животному, которое в последующем умертвляют, вскрывают и делают срезы тканей. С другой стороны, срезы тканей могут быть инкубированы с радиоактивными лигандами in vitro. Ткань (чаще всего мозг) рассекают (срез толщиной 20 мкм), обычно замораживают в криостате, помещают на предметное стекло. Инкубация происходит путем нанесения на срез ткани капли инкубируемого материала, содержащего радиоактивный лиганд. После инкубации, срез ткани быстро промывают и высушивают. Существуют различные техники визуализации радиоактивного лиганда. Требуется долгое время выдержки (от недели до нескольких месяцев), чтобы получить изображение после длительного выдерживания среза в фотографической эмульсии. Более короткое время (от нескольких дней до 1 недели) нужно для получения изображения с помощью фосфора. Самый быстрый метод - использование β-отображателя, который способен воспроизводить изображение поглощенной радиоактивности, требующий 1 суток и позволяющий получить до 15 предметных стекол, подсчет на которых может производиться одновременно. Изображение анализируется и производится количественное определение путем подсчета числа β-частиц, испускаемых с определенной области мозга с использованием β-регистрирующих программ Biospace Lab, Paris, France) [4].

В соответствии с нейроанатомическими картами, ауторадиографические техники могут быть использованы для измерения занятости рецепторов немеченными лекарственными средствами. Вещества, в различных дозах, регулярно вводятся лабораторным животным, которые затем умерщвляются, их ткани рассекаются и быстро инкубируются с радиоактивным лигандом на рецептор-мишень. Отличие выявления меток в определенной области аналогичных органов животных, которым вводилось лекарственное средство, и которым не вводилось, является мерой занятости рецепторов лекарственным средством, для которого эти рецепторы являются мишенью. Эта ex vivo инкубационная методика применима только для лекарственных средств с достаточно низкой константой диссоциации комплекса «лиганд-рецептор». Либо, радиоактивный лиганд может быть введен животному, которому систематически вводили лекарственное средство, таким образом конкуренция лиганда и лекарственного средства за рецептор будет протекать in vivo. Впоследствии, животное умерщвляют, ткани рассекают, делают срезы, которые обрабатывают вышеописанным методом. С открытием высокочувствивтельного β-отображателя в 1990х, получение изображения требует несколько часов, а определение занятости рецепторов лекарственным средством стало ценной скрининговой методикой [4].