Определение активности холинэстераз

В тканях человека и животных содержатся ацетилхолинэстераза (ацетилги-дролаза ацетилхолина; КФ 3.1.1.7; ацетилхолингидролаза, «истинная» холинэстераза), локализующаяся в нервной ткани и эритроцитах крови, и холинэстераза (ацилгидролаза ацилхолинов, КФ 3.1.1.8; ацилхолингидролаза «неспеци­фическая», или псевдохолинэстераза), которая содержится практически во всех тканях человеческого организма и в плазме крови.

Оба фермента расщепляют эфиры холина на холин и соответствующую кислоту и отличаются своей специфичностью. Так, ацетилхолинэстераза (АХЭ) гидролизует в основном ацетилхолин (АХ), за что этот фермент раньше называли специфической холинэстеразой. Холинэстераза (ХЭ) же способна расщеплять гораздо большее число субстратов, в частности и бутирилхолин (причем в два раза быстрее, чем ацетилхолин). Поэтому она еще известна как бутирилхолинэстераза, или ложная, сывороточная холинэстераза. Поскольку фермент синтезируется в печени, степень активности холинэстеразы крови служит тестом, отражающим функциональное состояние печени.

Ацетилхолинэстераза имеет непосредственное отношение к проведению нервного импульса. Выделяющийся из везикул через пресинаптическую мем­брану (проницаемость которой повышается вследствие деполяризации, вы­званной распространением по нервному проводнику «тока действия») ацетил­холин, оказавшийся в синаптической щели, производит характерное влияние на постсинаптическую мембрану, вызывая ее деполяризацию и зарождая тем самым нервный импульс, распространяющийся по аксону нервной клетки в виде «тока действия». При разрушении АХ ацетилхолинэстеразой достигается реполяризация постсинаптической мембраны, что создает условия для возникновения и продолжения актов распространения нервного импульса.

СНзСООСН ₂СН ₂ N* (СH ₃ )з + H ₂0 ^AХЭ CH ₃COOH + HOCH ₂ CH ₂N * (CН₃ ) ₃

ацетилхолин уксусная холин

кислота

Система «ацетилхолин—холинэстераза» участвует в регуляции возбудимости и сократимости гладкой и сердечной мышц

Наиболее богатыми источникамиАХЭ является серое вещество централь­ной нервной системы, симпатические ганглии, двигательные нервные окон­чания и эритроциты.

Холинэстераза обнаружена в печени (откуда секретируется в плазму вместе с альбумином, вырабатываясь в одном с ним локусе), сли­зистой оболочке кишечника, поджелудочной железе, легких, белом веществе головного мозга и других образований центральной нервной системы.

Ацетилхолинэстераза — в основном мембраносвязанный фермент, тогда как холинэстераза - цитоплазматический.

Фермент относительно стабилен. Сыворотка может храниться при температу­ре 0—5°С в течение 14 сут без снижения активности. Эритроциты могут храниться около 4 сут при температуре 2—6°С без заметной потери активности энзима.

Методы определения активности холинэстеразы делятся на:

1) манометрические (выполняемые в аппарате Варбурга). Реакция осуществ­ляется в гидрокарбонатном буфере (рН 7,4), в атмосфере 95% азота и 5% углекислого газа. Образующаяся при гидролизе ацетилхолина уксусная кислота, реагируя с гидрокарбонатом, вытесняет из него углекислый газ. По величине производимого им давления судят об активности фермента;

2) титриметрические.

3) колориметрические (методы определения по конечной точке). Классиче­ский гидроксаматный метод основан на реакции ацетилхолина со ще­лочным раствором гидроксиламина, в результате чего образуется ацетил-гидроксамовая кислота, которая в присутствии солей трехвалентного же­леза дает пурпурно-красное окрашивание (Hestrin, 1949).

4) спектрофотометрические - основывающиеся на определении количест­ва гидролизованного бензоилхолина по светопоглощению в ультрафиолето­вой области спектра.

В клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических уч­реждений широко используются простой колориметрический метод, основан­ный на измерении количества уксусной кислоты, образуемой при ферментатив­ном расщеплении ацетилхолина, и экспресс-метод исследования активности хо­линэстеразы в сыворотке крови с применением индикаторной тест-полоски.

Анализируемая проба сыворотки стабильна при комнатной температуре в течение 6 ч, при 4°С - 1 нед, при -70°С - 6 мес. Не следует допускать гемоли-за, оттаивания и повторного замораживания проб.

Работа №34 Определение активности сьюороточной холинэстеразы колориметрическим методом

Принцип метода. Под действием холинэстеразы происходит гидролиз аце-тилхолинхлорида с выделением уксусной кислоты и холина. Уксусная кислота подкисляет реакционную среду, что устанавливают с помощью индикатора по изменению цвета буферного раствора.

Реактивы

1. 0,9 моль/л раствора ацетилхолинхлорида. 1,67 г ацетилхолинхлорида растворяют в 10 мл воды либо содержимое ампулы с ацетилхолинхлори-дом (0,2 г) в 1,2 мл дистиллированной воды. Реактив хранят в холодиль­нике. Годен в течение 6—7 сут (из-за гигроскопичности этого вещества открытую ампулу с ацетилхолинхлоридом держат в эксикаторе).

2. Вероналовый буфер, рН 8,4. 1,545 г натриевой соли веронала (мединала) растворяют в 500 мл дистиллированной воды, добавляют 9,0 мл 0,1 н рас' твора соляной кислоты и 150 мл раствора индикатора. Объем доводят дистиллированной водой до 1 л. Буфер хранят в холодильнике в зашм' щенном от света месте. Годен один месяц.

Методы клинической химии и интерпретация получаемых с их использованием результатов

3. Индикатор феноловый красный. Зона перемены окраски индикатора (от желтой к красной) лежит в пределах рН 6,8—8,4. 0,1 г сухого инди­катора растирают в ступке с 5,7 мл 0,05 н раствора едкого натра и по­сле растворения смеси объем доливают дистиллированной водой до 25 мл. Из полученного основного раствора (4 г/л) готовят его разведе­ние (0,1 г/л) путем разбавления основного раствора дистиллирован­ной водой в 40 раз.

4. Водный раствор прозерина, 7 г/л.

5.0,1 н раствор уксусной кислоты. Готовят из фиксанала или при его отсут­ствии путем растворения 3 г (2,84 мл) ледяной уксусной кислоты в 500 мл дистиллированной воды.

Ход определения. В пробирку вносят 5,0 мл вероналового буфера, 0,2 мл дистиллированной воды и 0,1 мл сыворотки. Смесь прогревают при 37"С в те­чение 5 мин. Затем к ней добавляют 0,2 мл раствора ацетилхолинхлорида и ин­кубируют 30 мин при 37°С. После инкубации доливают в пробирку 0,2 мл рас­твора прозерина. Абсорбцию измеряют на ФЭКе с зеленым светофильтром (500-560 нм) в кювете с толщиной слоя 5 мм. При использовании современ­ного, более чувствительного фотометра (типа PV-1251 С «СОЛАР») объем пе­речисленных компонентов смеси может быть уменьшен в 2—3 раза. Фотомет-рирование проводят в пределах одного часа.

Контрольную пробу ставят так же, как опытную, но раствор прозерина вно­сят в пробирку вместе с ацетилхолинхлоридом. Из показателей абсорбции контрольной пробы вычитают значения оптической плотности опытной.

Рассчитывают активность холинэстеразы по калибровочному графику, выра­жая ее в ммоль уксусной кислоты на 1 л сыворотки за 1 ч инкубации.

С целью получения данных для построения калибровочного графика необ­ходимо из 0,1 н раствора уксусной кислоты приготовить разведения, как указа­но в таблице 3. Из каждого раствора отобрать по 0,2 мл, смешать это количе­ство с 5,1 мл буфера, к содержимому пробирки добавить 0,2 мл раствора прозерина и 0,2 мл раствора ацетилхолинхлорида, после чего измерить абсорбцию в условиях фотометрии опытных проб.

Таблица 3