Работа №30 Определение активности щелочной фосфатазы в сыворотке крови методом конечной точки по Бессею, Лоури, Броку
Принцип метода. Метод основывается на учете количества образовавшегося в результате ферментативного расщепления р-нитрофенилфосфата р-нитрофенола, дающего в щелочной среде желтое окрашивание. Интенсивность окраски фотометрируемого раствора пропорциональна активности фермента Реактивы 1. Раствор р-нитрофенилфосфата натрия (субстрата) в 0,001 н растворе соляной кислоты, 4 г/л, рН 6,5—8,0. 2. Буферный раствор. 0,05 моль/л вероналового буфера (рН 10,5), в который вносят хлористый магний (95 мг/л). Реактив хранят в холодильнике. 3. Субстратно-буферный раствор для исследования активности щелочной фосфатазы. 4. 0,02 н раствор едкого натра. Готовят на дистиллированной воде, освобожденной от углекислого газа путем предварительного кипячения. 5. Стандартный раствор р-нитрофенола — 5 • 10 моль/л. Ход определения. В предназначенные для постановки опытных и контрольных проб пробирки вносят по 0,5 мл субстратно-буферного раствора, содержимое их прогревают при температуре 37° С в течение 5 мин; затем в опытные пробы добавляют по 0,05 мл сыворотки. Содержимое пробирок перемешивают и инкубируют 30 мин при 37°С (лучше на водяной бане). После инкубации в каждую из пробирок интенсивной струёй вносят 5 мл раствора гидроксида натрия, а в контрольные пробы — по 0,05 мл сыворотки крови. Содержимое пробирок перемешивают и фотометрируют в кювете с толщиной слоя 10 мм при длине волны 415 нм (400-420 нм - фиолетовый светофильтр). Полученные результаты сравнивают с соответствующими данными контрольных проб, выполняемых для каждой исследуемой сыворотки крови (прежде всего, чтобы учесть мешающее определению влияние билирубина). Находят разность абсорбции опытной и контрольной проб и по калибровочной кривой (либо выводимому из нее фактору) оценивают активность фермента в размерности «ммоль/ч • л)». Выраженная в единицах Бессея активность щелочной фосфатазы численно равна количеству ммоль р-нитрофенола, которое выделилось бы в процессе часовой реакции (37°С) при взаимодействии субстрата с 1 л сыворотки крови. Расчет активности щелочной фосфатазы в сыворотке (плазме) крови осуществляют по калибровочной кривой. Данные к ее построению приведены в таблице. Для построения калибровочной кривой нужно 1, 2, 3, 5 и 7 мл рабочего стандартного раствора, содержащего соответственно 0,05, 0,10, 0,15, 0,25 и 0,35 мкмоль р-нитрофенола, довести 0,02 н раствором NaOH до объема 11,1 мл (табл.1) и измерить оптическую плотность смеси с учетом абсорбции, приходящейся на 0,02 н раствор NaOH, использующийся в качестве контрольной пробы. Строят градуировочную кривую, откладывая на оси ординат значения абсорбции, а на оси абсцисс — активность фермента в ммоль р-нитрофенола/(ч • л). Активность щелочной фосфатазы в сыворотке крови практически здоровых взрослых людей составляет 0,5—1,3 ммоль/(ч • л), или 0,5—1,3 ед Бессея—Лоу-ри—Брока. У детей в возрасте до 12 лет она в 1,5 раза выше.
Таблица 1 Данные к построению градуировочного графика для определения активности щелочной фосфатазы
Примечания. 1. Сыворотка не должна быть гемолизирована. 2. Щелочная фосфатаза плазмы (сыворотки) крови термостабильна, поэтому сыворотка может храниться при комнатной температуре в течение нескольких суток. 3. Ложное повышение активности фермента наблюдается при хранении сыворотки в холодильнике в течение 12—24 ч, а также после внутривенного введения плацентарного альбумина. 4. У практически здоровых людей, имеющих группу крови В и О, уровень активности щелочной фосфатазы повышается после приема жирной пищи. 5. Кровь для определения активности щелочной фосфатазы следует брать у обследуемого через несколько суток после приема сульфаниламидных препаратов и антибиотиков. 6. Определение желательно провести не позднее чем через 6 ч хранения образца при комнатной температуре и 5 сут хранения в холодильнике (2-8°С). По мере согревания охлажденных проб биологической жидкости активность ЩФ в них непрерывно повышается. 7. Исследование активности кислой фосфатазы (общей и простатической) может быть выполнено также в секрете простаты и эякуляте. До проведения исследования биологические жидкости сохраняют в холодильнике при 4°С и центрифугируют в условиях охлаждения на обычной центрифуге (типа ОПН-3) при 3000 об/мин в течение 20 мин. Ввиду высокой активности фермента в секрете или эякуляте надосадочную жидкость разводят цитратным буфером в 1000 раз. Для одновременного определения активности щелочной и кислой фосфатаз сыворотки (плазмы) крови двухточечным методом, доступным к использованию в лабораториях, оснащенных ординарной фотометрической аппаратурой, можно применять метод Бодански. Способ выражения активности фосфатаз (в ед Бодански) является устаревшим. В соответствии с требованиями используемой в клиниколабораторной практике Международной системы единиц активность эт ферментов следует оценивать по количеству выделенного неорганическ фосфора (в ммоль) при действии на субстрат 1 л сыворотки за время инкУ ции 1 ч при +37°С. Пересчет производится по формуле: а * 474,19. В норме активность щелочной фосфатазы составляет у взрослых 0,05-1,3 ммоль/(ч • л), кислой фосфатазы - 0,05-0,13 ммоль/(ч • л). Примечание: не рекомендуется брать кровь для анализа активности кислой фосфатазы в течение 24 ч после массажа простаты или ее инструментального исследования.
Популярное: Почему двоичная система счисления так распространена?: Каждая цифра должна быть как-то представлена на физическом носителе... Почему человек чувствует себя несчастным?: Для начала определим, что такое несчастье. Несчастьем мы будем считать психологическое состояние... Как построить свою речь (словесное оформление):
При подготовке публичного выступления перед оратором возникает вопрос, как лучше словесно оформить свою... Модели организации как закрытой, открытой, частично открытой системы: Закрытая система имеет жесткие фиксированные границы, ее действия относительно независимы... ©2015-2024 megaobuchalka.ru Все материалы представленные на сайте исключительно с целью ознакомления читателями и не преследуют коммерческих целей или нарушение авторских прав. (3010)
|
Почему 1285321 студент выбрали МегаОбучалку... Система поиска информации Мобильная версия сайта Удобная навигация Нет шокирующей рекламы |