Работа №31 Определение активности альфа-амилазы методом Каравея

Принцип метода. Метод базируется на колориметрическом определении концентрации крахмала до и после его ферментативного гидролиза.

Реактивы

1. Раствор субстрата рН 7,2—7,4. 13,3 г безводного двузамещенного фосфорнокислого натрия и 4,3 г бензойной кислоты вносят в 250 мл доведенной до кипения дистиллированной воды и некоторое время кипятят раствор. Суспендируют 0,2 г «растворимого» крахмала в небольшом ко­личестве холодной воды и вливают в кипящую смесь, поддерживают ее в таком состоянии в течение 1 мин. Затем смесь охлаждают и доводят водой до 500 мл.

Раствор устойчив при комнатной температуре, однако его желательно готовить заново каждые двое суток либо 2 раза в неделю. Он должен со­хранять прозрачность. Следует обращать особое внимание на показатель рН приготовленного субстрата (должен быть не менее 6,8). Для доведения рН раствора до необходимых значений (7,2—7,4) можно изме- нить соотношение между количеством используемого для его приготов­ления фосфата натрия и бензойной кислоты либо в случае получения кислого раствора добавить 5 н раствор NaOH.

2. 0,1 н основной раствор йода, который может быть получен следующими способами: а) из фиксанала; б) из кристаллического йода и йодистого ка­лия: 30 г KI растворяют в 250 мл дистиллированной воды, туда же вносят 12,7 г йода и доводят объем дистиллированной водой до 1000 мл. Полу­ченный раствор (Люголя) хранят в темноте, он стоек; в) из йодата калия и йодистого калия: 3,567 г йодноватокислого калия (КЮз) и 45 г KI раство­ряют в 800 мл воды и медленно, при помешивании, добавляют 9 мл кон­центрированной соляной (хлористоводородной) кислоты, а затем доли­вают водой до объема 1000 мл.

4. Рабочий (0,01 н) раствор йода. 25 г фтористого калия растворяют в 350 w воды, вводят 50 мл основного раствора йода и доводят водой до объема 500 мл. Годность раствора — около 2 мес при условии хранения в посудб из темного стекла в холодильнике. Рабочий раствор йода без добавления в него фтористого калия следует готовить ежедневно.

Ход определения В обычную химическую пробирку вносят 1 мл раствора крахмала, субстрат прогревают 5 мин в водяной бане при 37°С, после чего к нему добавляют 0,02 мл негемолизированной сыворотки. Пробу вновь поме­щают ровно на 5 мин в водяную баню (в суховоздушном термостате для этого должны быть баночки с водой). Контрольную пробу проводят так же, как опытную, но сыворотку в нее не вносят. Затем во все пробирки (опытные и контрольные) доливают по 1 мл рабочего раствора йода и по 8 мл дистилли­рованной воды, пробирки хорошо взбалтывают и содержащиеся в них раство­ры колориметрируют на любом фотометре, например ФЭКе, с красным све­тофильтром (630—690 нм) в кювете с шириной слоя 10 мм. При учете оптической плотности проб в качестве раствора для сравнения используют дистиллированную воду. Рассчитывают активность альфа-амилазы в г расщепленного крахмала на 1 л сыворотки за 1 ч инкубации при +37"С по формуле:

(Ак-Аоп) : Ак-240,

где 240 есть величина, получаемая умножением 0,4 (количество крахмала, мг, внесенного в опытную и контрольную пробы) на 600; 600 =50 • 12 (50—коэф­фициент пересчета на количество крахмала в г, гидролизованного 1 л сыворот­ки), 12 - коэффициент пересчета с 5 мин на 60 мин.

нормы: активность фермента в сыворотке крови — 16—30 г/(ч • л), моче - 28-160 г/(ч • л), в среднем - 107±5,1 г/(ч • л).

Примечания.

1. Для определения активности альфа-амилазы рекомендуется использо­вать свежую сыворотку и мочу. Наряду с утверждением, что активность фермента стабильна при комнатной температуре в течение недели, а при 4°С или при -20°С в течение месяца, имеются сведения и о том, что она снижается уже через несколько часов хранения биологического ма­териала, как при комнатной температуре, так и при 4°С.

2. Слабый гемолиз не мешает исследованию.

3. Лимоннокислую и щавелевоуксусную плазму и плазму, приготовленную на ЭДТА, применять нельзя, так как цитраты и оксалаты ингибируют активность фермента.

4. Желательно ставить контрольную пробу на каждую исследуемую сыво­ротку, внося ее в пробирку после периода инкубации.

5. Интенсивность окраски йодокрахмального раствора обратно пропорци­ональна колебаниям температуры. Поэтому надо следить за тем, чтобы в опытной и контрольной пробе во время цветной реакции температура была постоянной.

6. Профильтрованную мочу можно использовать и неразведенной. Од­нако при активности фермента выше 140 г/(ч • л) мочу следует разве­сти (или укоротить период ее инкубации), что соответственно долж­но учитываться при расчете активности ферментов. В случае высокой гиперферментемии мочу разводят в 100 раз.

7. Нормальные показатели активности фермента для сыворотки крови и мочи желательно проверять на донорах в каждой лаборатории.

8. При определении амилазной активности нужно иметь в виду, что слюна содержит в 1000 и 10 000 раз больше фермента, чем сыворотка. Пот так­же обладает амилазной активностью. Так, при закрывании встряхивае­мой в руках пробирки большим пальцем активность амилазы в анализи­руемой пробе возрастала на 25—80%.

9. Активность альфа-амилазы повышают ионы кальция.

10. Если определение активности альфа-амилазы мочи откладывается более чем на 1 ч после взятия крови, моча должна быть заморожена.

11. Ход ферментативной реакции во многом зависит от качества исполь­зуемого субстрата.