Работа №35 Цитохимический метод определения миелопероксидазы (МП) нейтрофилов

Принцип. В присутствии МП бензидин окисляется перекисью водорода в коричневый оксибензидин. Фермент локализуется в специфической зернистости цитоплазмы гранулоцитов и является маркером клеток миелоидной природы. Роль фермента заключается в том, что он разрушает токсическую перекись водорода, образующуюся в процессе жизнедеятельности клеток.

Реактивы:

1) Формалин 4% спиртовой раствор /10 частей 40% формалина и 90 частей спирта/;

2) Реакционная смесь: бензидин 0,5 г (на кончике ножа) растворяют при встряхивании в 100 мл дистил. воды и добавляют 0,3 мл 3% раствора перекиси водорода. Реактив годен в течении 5-6 дней;

3) Метиленовый зеленый 0,5 % раствор.

Ход определения:

Мазки крови высушивают на воздухе и фиксируют в растворе формалина 1-2 мин. Затем промывают водой. Фиксированные мазки выдерживают в течение 10 минут в реакционной смеси. Быстро докрашивают 0,5% метиленовым зеленым (или метиленовым синим) -2 мин.

Активность фермента выявляется в клетках гранулоцитов в виде желто-коричневых гранул (зерен), которые определяют при микроскопии с иммерсией.

Оценка:

+ /слабо положительная реакция/ - это 1-2 зернышка или небольшое окрашивание цитоплазмы.

++ / положительная реакция/ - зерна на 1/3 цитоплазмы.

+++ /интенсивная реакция/ - зерна на 1/2 - 2/3 цитоплазмы.

++++ /резко положительная реакция/ - зерна на всю цитоплазму.

Расчет по формуле СЦК/средний цитохимический коэффициент/:

4а+Зб+2в+1г+Од

СЦК= —————————,где

цифры - степень активности МП;

буквы - число клеток с той или иной активностью;

100 — общее число подсчитанных нейтрофилов.

Нормы: СЦК 2,56 ±0.03.

Клинико-диагностическое значение

Активность миелопероксидазы в нейтрофилах снижена при инфаркте миокарда, обострении ревматизма, туберкулезе, опухолях. У больных с хроническим миелолейкозом, особенно в терминальной стадии, СЦК снижается до 1,65± 0,2 ед. В бластных клетках активность ферментов высокая при остром миелобластном лейкозе, слабая - при остром монобластном и отсутствует - при остром лимфобластном лейкозе.

Задания для контроля

1. Что называют активным центром ферментов? Перечислите этапы микрогетерогенного катализа в оганизме человека. Пути регуляции активности ферментов.

2. Что выражает уравнение Михаэлиса-Ментен? Анализ его.

3. Перечислите классы ферментов по типу катализируемой реакции и сложности строения молекулы фермента. Приведите соответствующие примеры.

4. Что называют изоферментами? Значение определения изоферментов в определении локализации патологического процесса в организме человека.

5. Перечислите ферменты, используемые в энзимодиагностике.

6. Перечислите ферменты, используемые в энзимотерапии.

7. Что называют энзимопатиями? Приведите примеры.

8. Какие условия рекомендуется соблюдать приколичественном измерении ферментов?

9. При каких условиях достигается скорость ферментативной реакции?

10. Назовите нормальные показатели ферментов (АсТ, АлТ; ЛДГ; ЩФ; КФ; КК; ХЭ; L – амилазы; МП) в сыворотке крови.

11. Какого КДЗ ферментов (АсТ, АлТ; ЛДГ; ЩФ; КФ; КК; ХЭ; L – амилазы; МП)?

Приложение 1

Список условных сокращений

Приложение 2