Andio R., D. Silvera, S. D. Suggett, P. L. Achacoso, 8 страница

Принимая во внимание результаты молекулярно-генетических исследований, вероятно, можно повысить уровень фиксации азота диазотрофными бактериями, модифицируя nifA- и nifL-гены. После введения с помощью методов генной инженерии дополнительных копий nifA-гена в штамм Rhizobium meliloti растения люцерны, зараженные этим рекомбинантным штаммом, достигали больших размеров и давали больше биомассы, чем растения, обработанные нетрансформированным штаммом. По-видимому, аналогичным образом можно поступить с nifL-геном, так чтобы белок NifL (негативный регуляторный фактор) стал бы менее чувствительным к присутствию связанного азота. При таком нарушении регуляции микроорганизм поставлял бы больше азота своему симбиотическому партнеру. Однако имеющиеся данные указывают на то, что не все азотфиксирующие организмы синтезируют белок NifL (y некоторых из них существенные области NifL могут быть составной частью NifA), так что подобный подход не является универсальным. Кроме того, увеличение количества азота, которое может фиксировать микроорганизм, приводит к увеличению количества энергии (обычно в форме связанного углерода), необходимой для обеспечения метаболизма. Следовательно, рекомби-нантный микроорганизм может оказаться неспособным стимулировать рост растения просто вследствие замедления своего роста.

Имея в виду всю сложность процесса фиксации азота микроорганизмами, можно сделать вывод, что простого введения в недиазотроф-ную клетку-реципиент одного или двух nif-генов недостаточно для того, чтобы она приобрела способность связывать азот. Более того, даже введение в геном растений полного кластера nif-генов длиной 24 т, п. н. не даст необходимого эффекта, поскольку при той концентрации кислорода, которая характерна для растительной клетки, нитрогеназа инактивируется. Если же концентрацию кислорода понизить, то растительная клетка вероятнее всего погибнет. Но в первую очередь попытки создания растительных клеток, способных связывать азот, требуют решения фундаментальных проблем транскрипции, трансляции и регуляции. Например, трудно представить, как будет осуществляться регуляция фиксации, поскольку у растений нет промоторов, с которыми связывался бы белок NifA. Следовательно, в таком трансгенном растении транскрипция nif-генов не будет инициироваться. Кроме того, чтобы реагировать на уровень связанного азота в клетке, все nif-гены должны находиться под контролем отдельных промоторов, поскольку растительные клетки неспособны процессировать мультигенные транскрипты. Учитывая все сказанное выше, приходится констатировать, что создание растений, способных фиксировать азот, вряд ли возможно.

Гидрогеназа

Нежелательная побочная реакиия фиксации азота — восстановление нитрогеназой Н⁺ до Н₂ (газообразный водород), в ходе которой энергия (в форме АТР) расходуется на образование водорода, который в конечном счете просто улетучивается. В результате только от 40 до 60% всего потока электронов, проходящих через нитрогеназный комплекс, передается на N₂, что значительно уменьшает эффективность процесса фиксации азота, В принципе, если бы Н₂ мог превратиться обратно в Н⁺, потери энергии были бы ниже, и процесс фиксации азота стал бы более эффективным. Устранить же эту побочную реакцию прямым путем невозможно, поскольку она обусловлена особенностями химического строения активного центра нитрогеназы, и если попытаться блокировать ее, изменив структуру фермента, то неизбежно произойдет и уменьшение активности нитрогеназы.

Метаболизм водорода

Всередине 1970-х годов было показано, что некоторые штаммы Bradyrhizobium japonicum могут расти в микроаэрофильных условиях (при

314 ГЛАВА 14

Рис. 14.5. Рециркуляция газообразного водорода - побочного продукта фиксации азота. Нитрогеназа катализирует образование водорода, используя энергию гидролиза АТР, а гидрогеназа катализирует его утилизацию.

низкой концентрации кислорода), используя в качестве источника энергии водород. Для этого они синтезируют фермент гидрогеназу, способную превращать атмосферный Н₂ в Н⁺ (рис. 14.5). Чтобы проверить, можно ли с помощью этих штаммов влиять на рост сои, растения инфицировали В. japonicutn, синтезирующими гидрогеназу (Нuр⁺). Растения давали большую биомассу и усваивали больше азота, чем те, которые были заражены Ηuρ^~-штаммами, даже несмотря на более высокий уровень нитрогеназной активности последних (табл. 14.3). По результатам этого и аналогичных экспериментов был сделан вывод, что наличие системы ассимиляции водорода у симбиотических диазотрофов типа В. japonicum повышает их способность стимулировать рост растений, по-видимому, в результате связывания и рециркуляции газообразного водорода, образующегося в клубеньках при участии нит-рогеназы (рис. 14.5).

Несмотря на выгоды, которые получает растение от симбиоза с диазотрофным микроорганизмом, обладающим системой повторного использования водорода, в природных условиях такая система при участии штаммов Rhizobium встречается редко. Согласно результатам тестирования, представленным в табл. 14,4, большинство рассмотренных природных штаммов Rhizobium и Bradyrhizobium имеют фенотип Hup^~. Было проверено по несколько штаммов каждого из указанных видов, а для В. japonicum их было более 1400. Ясно, что как только удастся достаточно подробно изучить генетическую природу гидрогеназной системы и идентифицировать соответствующие гены, коммерческие Нир~-штаммы Rhizobium будут первыми кандидатами на превращение в штаммы с фенотипом Нир⁺.

Модификация генов гидрогеназ

На изучение гидрогеназ как диазотрофных, так и недиазотрофных микроорганизмов в послед-

Таблица 14.3. Относительная активность нитрогеназы и гидрогеназы и способность В. japonicum Hup+ (SR) и трех Hup~ -мутантов (SRI, SR2 и SR3) стимулировать рост растений1) 2)
Штамм В, japonicum	Относительная активность нитрогеназы	Относительная активность гидрогеназы	Относительная сухая масса растения	Относительное содержание азота
" Из работы Albrecht et al. Science 203: 1255-1257, 1979.
г> Активность нитрогеназы оценивали по зависимости количества ацетилена, восстановленного до этилена, от времени; активность гидрогеназы определяли при помощи водородного электрода. Сухая масса растения включает массу листьев и корней. Содержание азота рассчитывали как долю сухой массы, приходящуюся на азот. Все величины нормированы относительно таковых для родительского штамма.

Бактерии, стимулирующие рост растений 315

Таблица 14.4. Доля природных штаммов Rhizobium и Bradyrhizobium, у которых есть система ассимиляции водорода (Hup+) 1)

Бактерия Штаммы Ηuρ+, %

1) Из работы Evans et al. Anna. Rev. Mlcrobiol. 41: 335-361, 1987.

ние 20 лет было затрачено много усилий, и тем не менее строение и функции этих ферментов до конца не установлены. Многие микроорганизмы синтезируют более одной гидрогеназы, при этом часто они состоят больше чем из одной полипептидной цепи. Одни гидрогеназы только связывают атмосферный водород, в то время как другие при соответствующих условиях могут также синтезировать его. Из всего этого следует, что вряд ли для преобразования штамма Hup~ Rhizobium в Нир⁺ будет достаточно простого включения в его геном гена одной из гидрогеназ. Включенный ген(ы) должен кодировать все субъединицы фермента. который должен быть совместим с электронтранспортной системой организма-хозяина.

Наиболее распространенная стратегия выделения генов гидрогеназ — генетическая комплементация. Первый из таких генов, ген мембраносвязанной гидрогеназы Е. colt, был идентифицирован методом комплементации у мутантной Е. coli, неспособной синтезировать активную гидрогеназу, с использованием банка клонов ДНК Е. coli дикого типа, созданного с помощью плазмиды pBR322. Мутант, содержащий дефектную мембраносвязанную гидрогеназу, не рос на минимальной среде в присутствии формиата, при этом активность эндоплазматической гидрогеназы оставалась неизменной. Трансформированные клетки, способные расти на такой среде, проверяли на присутствие в них активной гидрогеназы. Трансформант, у которого активность гидрогеназы восстановилась до такого же уровня, как у штамма дикого типа, содержал плазмиду, кодирующую белок мол. массой примерно 60 000 Да, что соответствует мол. массе одной из субъединиц мембраносвязанной гидрогеназы E. coli. Дальнейшие исследования показали, что в гидрогеназную систему E. coli входит множество генов.

Затем были идентифицированы гидрогеназные гены (hup) B. japonicum;для этого использовался банкклонон ДНК. дикого типа, созданный с помощью космидного вектора pLAFRl с широким кругом хозяев, и мутанты Hup^~ B. japonicum. Присутствие гидрогеназы, связывающей атмосферный водород, в трансформированных мутантных клетках Нир^~ определяли по способности активного фермента восстанавливать ме-тиленовый синий в атмосфере водорода. Более детальное исследование показало, что hup-гены В. japonicum образуют по крайней мере два, а возможно, и три оперона, охватывающих примерно 15 т.п.н., причем hup-гены Rhizobium leguminosarum аналогичны таковым В. japonicum как в отношении нуклеотидной последовательности, так и в том, что касается организации генов. Таким образом, идентифицированные hup-гены В. japonicum можо использовать в качестве гибридизационных зондов для поиска гомологичных генов из банка клонов R. leguminosarutn.

После идентификации Лир-генов R. ieguminosarum, несмотря на всю сложность гидрогеназной системы, удалось «переместить» ее из Hup⁺-штамма Л. leguminosarum в штамм Нир^~ (табл. 14.5). Растения бобов, на которых образовывали клубеньки бактерии рекомбинантного Hup⁺-штамма R. leguminosarum, росли быстрее и содержали больше азота, чем растения, инокулированные Нир^~-штаммом (табл. 14.5).

Работы по исследованию генов гидрогеназ не вызвали столь большого интереса, как исследования nif-генов, и тем не менее они убедительно продемонстрировали целесообразность применения методов генной инженерии для повышения способности диазотрофных микроорганизмов стимулировать рост растений. Теперь нужно проверить, приведет ли введение hup-генов в геномы других диазотрофных микроорганизмов (как несимбиотических, так и симбиотических) к такому же эффекту.

Гидрогеназная система может применяться не только для повышения эффективности фиксации азота. Так, очищенную гидрогеназу можно использовать для преобразования и запаса-

316ГЛАВА 14

Таблица 14.5. Рост растений и ассимиляция азота после введения генов hup в Нuр–-штамм R. leguminosarum1)

ния солнечной энергии; регенерации кофакторов, принимающих участие в промышленных ферментативных процессах; синтеза специфических химических соединений, требующего участия Н₂ в качестве восстановителя; для удаления трития из воды, которая использовалась для охлаждения реакторов атомных электростанций; для синтеза Н₂ из органических отходов; получения водородно-кислородных топливных ячеек. Однако, несмотря на то что уже идентифицировано и охарактеризовано более дюжины генов гидрогеназ, пока ни один из них не использовался для крупномасштабного синтеза этих ферментов.

Образование клубеньков

Конкуренция среди организмов, образующих клубеньки

Одна из основных задач сельскохозяйственной биотехнологии — создание с помощью методов генной инженерии штаммов Rhizobium, которые повышали бы урожайность растений более эффективно, чем природные штаммы. Многие имеющиеся на рынке штаммы-инокуляты -превосходные азотфиксаторы — были созданы путем мутагенеза и последующего отбора, однако они в недостаточной степени стимулируют образование клубеньков на корнях растения-хозяина в условиях конкуренции с природными штаммами Rhizobium, уже присутствующими в почве. И наоборот, многие природные штаммы с успехом выдерживают конкуренцию с лабораторными штаммами, но малоэффективны в отношении фиксации азота. Таким образом, для того чтобы можно было реально использовать имеющиеся на рынке инокулирующие штаммы, необходимо либо повысить их способность образовывать клубеньки, либо устранить природные штаммы Rhizobium.

Были проведены исследования, направленные на определение генетической основы «конкурентоспособности» природных штаммов, с тем чтобы затем попытаться ввести соответствующие гены в штаммы-инокуляты.

Манипуляции с генами образования клубеньков

Для идентификации генов образования клубеньков (nod-генов)вновь использовали генетическую комплементацию. Не способный образовывать клубеньки (Nod^~) мутантный штамм R. meliloti трансформировали банком клонов хромосомной ДНК R. meliloti дикого типа и выделяли колонии, приобретшие способность образовывать клубеньки на корнях люцерны (рис. 14.6). Стратегия заключалась в следующем.

1, С помощью частичного гидролиза ДНК R. meiiloti рестриктазой EcoRIи встраивания фрагментов длиной до 40 т. п. н. в уникальный EсоRI-сайт космиды рLАFR1 с широким кругом хозяев был создан банк клонов хромосомной ДНК R. meliloti дикого типа (Nod⁺).

2, Рекомбинантные плазмиды упаковали в частицы фага λ, ввели в Е. coli, a затем перенесли в клетки Nod^~-штамма R. meliloti при помощи конъюгации. Вектор содержал ген устойчивости к тетрациклину, который можно было использовать как селективный маркер и в случае Е. coli, и в случае R. meliloti.

3, После конъюгации суспензии, содержащие от 200 до 300 трансформированных клеток R. meliloti, проверяли на способность инициировать образование клубеньков у стерильных растений люцерны. Ожидалось, что этой способностью будут обладать только транс-

Бактерии,стимулирующие рост растений 317

Рис. 14.6. Идентификация генов образования клубеньков R. meliloti. ДНК R. meliloti дикого типа встраивают в космиду pLAFRI с широким кругом хозяев, упаковывают в частицы фага λ и вводят в Е. coli. Банк клонов переносят из Е. coli в Nod~-штамм R. meliloti при помощи конъюгации. Растения люцерны инокулируют трансформированными R. meliloti Nod~: растения, образующие корневые клубеньки, инфицированы A meliloti Nod+, клетки которых, по-видимому, несут комплементирующий ген образования клубеньков в составе космидного вектора. Из корневых клубеньков выделяют трансформированные Nod+-клетки R. meliloti.

318 ГЛАВА 14

форманты, которые несут и экспрессируют ген, комплементирующий дефект образования клубеньков в клетках R, meliloti.

4. Из клубеньков выделили бактерии, вызывающие образование клубеньков, а из бактерий -вектор, несущий комплементирующий ген. Содержащую этот ген большую вставку переклонировал и и провели дальнейший анализ,

5. Идентифицированный ген образования клубеньков использовали в качестве зонда для обнаружения фланкирующих его участков хромосомной ДНК R. meliloti в геномной библиотеке.

В результате этих весьма трудоемких экспериментов удалось охарактеризовать весь набор генов образования клубеньков R. meliloti. Детальные биохимические и генетические исследования показали, что образование клубеньков и его регуляция — это сложные процессы, в которых задействованы продукты большого количества генов (примерно 20; табл. 14.6). Одни

из этих генов высококонсервативны (одинаковы у всех микроорганизмов, образующих клубеньки), другие видоспецифичны. Их можно сгруппировать в три отдельных класса: консервативные, видоспецифичные и регуляторный ген nodD. Так, nodABC-гены одинаковы у всех видов Rhizobium и структурно взаимозаменяемы; у большинства видов они образуют один оперон.

Установлено, что процесс образования клубеньков включает несколько этапов. Сначала продукт конститутивно экс премирующегося гена nodD связывается с молекулой флавоноида, секретируемого клетками корней растения-хозяина. Флавоноиды — это растительные фенольные соединения, структурную основу которых составляют два ароматических кольца, соединенных друг с другом трехуглеродным мостиком. Они выполняют в растениях разные функции, в частности отвечают за их пигментацию и участвуют в защите от грибов и насекомых. Связывание флавоноидов с белком NodD -

Бактерии, стимулирующие рост растений319

Идентификация генов образования клубеньков Rhizobium meliloti путем прямой комплементации Nod–- мутантов

S. R. Long, W. J. Buikenia, F. M. Ausubel Nature 298: 485-488, 1982

один из ключевых моментов идентификации растения-хозяина, поскольку каждый вид Rhizobium узнает ограниченное число флавоноидных структур, а каждая разновидность растений синтезирует свой специфический набор этих молекул. Одни штаммы, например R. leguminosarum biovar (bv.) trifolii, имеют очень узкий круг хозяев, поскольку узнают только несколько видов флавоноидов, а у других штаммов, например у NGR234 Rhizobium sp., круг хозяев очень широк.

Присоединение молекул флавоноида активирует белковый продукт NodD, по-видимому, вызывая его конформационное изменение. Далее комплекс флавоноид—NodD связывается с промоторным участком генов образования клубеньков, называемым nod-блоком. Этот участок расположен перед всеми генами образования клубеньков, кроме гена nodD, и запускает их транскрипцию.

Гены nodABC кодируют белки, которые вызывают набухание и скручивание корневых во-

320ГЛАВА 14

Рис. 14.7. Предполагаемая структура олигосахаридного фактора NodRm-1. Это соединение обусловливает специфический ответ растения-хозяина, в том числе скручивание и деформацию корня.

лосков, что считается первым шагом инфицирования корня растения бактерией. Вместе растение и бактерии синтезируют некий олигосахаридный фактор, который модифицируется генным продуктом NodH, a возможно, и продуктами NodQ и NodP. Этот фактор, обозначаемый NodRm-1 (рис. 14.7), обусловливает специфический ответ растения-хозяина, в том числе скручивание и деформацию корня.

В зависимости от штамма Rhizobium или Bradyrhizobium, в конце концов синтезируется примерно 20 дополнительных продуктов nod-генов. Вместе с некоторыми белками, кодируемыми растениями, они участвуют в формировании клубенька.

Чтобы выяснить роль каждого из идентифицированных nod-генов. необходимо провести дополнительные исследования; кроме того, не исключено, что со временем обнаружатся новые nod-гены. Например, секвенирование ДНК и компьютерный анализ показали, что у медленнорастущей формы Bradyrhizobium sp, область ДНК между nodD- и nodABC-генами содержит открытую рамку считывания, а у быстрорастущей формы этой последовательности нет. Открытую рамку считывания обозначили поdК. При инокуляции растений штаммом Bradyrhizobium sp. с мутантным nodK-геном (NodK ) клубеньки на них начинают образовываться на 5 дней раньше, чем у растений, зараженных штаммом дикого типа; при этом число клубеньков удваивается, а урожайность растений увеличивается на 120%.

К настоящему времени не удалось разработать простых генетических подходов, которые позволяли бы использовать nod-гены для повышения конкурентоспособности инокулирую-щих штаммов Rhizobium. Впрочем, можно изменить видоспецифичность бактерий путем переноса nodD-гена из штамма Rhizobium с широкой специфичностью в один из штаммов с узкой специфичностью. Так или иначе, ясно, что образование клубеньков — весьма сложный процесс, и для дальнейшего увеличения конкурентоспособности штаммов Rhizobium потребуются всесторонние исследования с использованием методов генной инженерии.

Биоконтроль патогенных микроорганизмов

Бактерии, стимулирующие рост растений, могут оказывать свое действие прямо или косвенно. Прямая стимуляция обычно состоит в поставке

Бактерии, стимулирующие рост растений 321

растению какого-либо соединения, синтезируемого бактерией (это может быть, например, связанный азот), или растительного гормона. Кроме того, бактерии могут облегчать поглощение растением из окружающей среды некоторых веществ, например железа или фосфора. Косвенная стимуляция заключается в том, что бактерии уменьшают или предотвращают вредное влияние одного или нескольких фитопатогенных организмов — грибов или бактерий. Фитопатогены могут уменьшать урожайность сельскохозяйственных культур на 25—100%, что наносит огромный ушерб. Обычно для борьбы с ними используют химикаты. К сожалению, в большинстве случаев симптомы заболеваний у растений не проявляются достаточно долго, до тех пор, пока изменения в окружающей среде не вызовут пролиферацию бактерий и не приведут к быстрому развитию болезни и к уничтожению всего урожая. Контроль таких обширных эпидемий трудноосушествим и требует больших денежных затрат.

Многие химикаты, использующиеся для борьбы с фитопатогенами, представляют опасность для животных и человека; они накапливаются в природных экосистемах и долго сохраняются в них. Поэтому было бы целесообразно заменить химические способы подавления патогенных микроорганизмов биологическими, более «благоприятными» для среды. Один из биологических подходов к контролю фитопатогенов заключается в создании трансгенных растений, устойчивых к одному или нескольким патогенным микроорганизмам (этот подход обсуждается в гл. 18). Были также предприняты попытки использовать в качестве инструмента биоконтроля бактерии, стимулирующие рост растений. Такие бактерии синтезируют соединения, которые можно использовать для уменьшения ущерба, наносимого растениям фитопатогенами. В их числе —сидерофоры и антибиотики, а также различные ферменты. Впрочем, несмотря на всю перспективность этого подхода, почти все исследования пока проводились в лабораторных условиях, ростовых камерах или в оранжереях. Окончательный же вывод о пользе той или иной стратегии, основанной на использовании какого-то конкретного механизма, можно будет сделать только после полевых испытаний.