В аптеку поступили препараты, используемые для лечения диабета: «Инсулин цинк суспензия кристаллическая», «Инсулин для инъекций», «Инсулин человеческий»

Ситуационная задача № 31.

1. Провизору необходимо охарактеризовать препараты по следующим вопросам:

± При каком типе диабета используют инъекционные формы инсулина?

Инъекционные формы инсулина необходимы при сахарном диабете I типа. При сахарном диабете I типа поджелудочная железа вырабатывает недостаточное количество инсулина или практически вообще его не вырабатывает. Глюкоза не может попасть в клетки, и её уровень в крови агрессивно повышается. Человек начинает испытывать жажду, сухость во рту, выделяет большое количество мочи; теряет вес. Для того, чтобы избавить его от этих симптомов и снизить уровень сахара в крови, необходим инсулин. Инсулин - это белковый гормон и вводить его можно только при помощи инъекций, так как при попадании в желудок он разрушается, и выполнять свои функции уже не может.

± Каковы различия в первичной структуре инсулина, получаемого из различных источников сырья и могут ли эти различия сказываться на действии лекарственного препарата?

Впервые инсулин был получен Бантингом и Вестом в 1921 году из поджелудочной железы собаки. В дальнейшем велись поиски наиболее подходящего для человека инсулина. Использовали даже китовый инсулин. Но самым близким к человеческому оказался инсулин из поджелудочной железы свиньи. Инсулин свиньи и быка отличается от человеческого по аминокислотному составу: бычий - по трем аминокислотам, а свиной - по одной. Неудивительно, что при лечении бычьим инсулином побочные реакции развиваются гораздо чаще, чем при терапии свиным или человеческим инсулином. Эти реакции выражаются в иммунологической инсулинорезистентности, аллергии к инсулину, липодистрофиях (изменении подкожножировой клетчатки в месте инъекции).

Несмотря на явные недостатки бычьего инсулина, он все еще широко используется в мире, прежде всего в развивающихся странах, большим количеством больных, поскольку благодаря избытку сырья производство его обходится недорого. И все же недостатки бычьего инсулина в иммунологическом плане столь очевидны, что его ни в коем случае не рекомендуется назначать больным впервые выявленным сахарным диабетом, беременным или для кратковременной инсулинотерапии, например в периоперационном периоде. Отрицательные качества бычьего инсулина сохраняются и при использовании его в смеси со свиным, поэтому смешанные (свиной+бычий) инсулины также не стоит использовать для терапии указанных категорий больных.

На сегодняшний день выпуск и применение инсулинов животного происхождения в развитых странах мира практически прекращены.

± Каковы основные этапы получения препаратов инсулина из животного сырья, а также путем микробиологического синтеза?

Инсулин человека можно производить четырьмя способами: 1) полным химическим синтезом; 2) экстракцией из поджелудочных желез человека (оба этих способа не подходят из-за неэкономичности: недостаточной разработанности первого способа и недостатка сырья для массового производства вторым способом); 3) полусинтетическим методом с помощью ферментно-химической замены в положении 30 В-цепи аминокислоты аланина в свином инсулине на треонин; 4) биосинтетическим способом по генноинженерной технологии. Два последних метода позволяют получить человеческий инсулин высокой степени очистки.

Промышленное производство человеческих инсулинов в настоящее время во всем мире осуществляется двумя способами:

1) путем ферментативной обработки свиного инсулина – полусинтетический инсулин;

2) с помощью генно-инженерной технологии – биосинтетический инсулин.

Преимущество полусинтетического метода в том, что исходное вещество (свиной инсулин) получают и очищают давно и хорошо известными и усовершенствованными способами. Появлению вторичных примесей после ферментно-химической обработки можно воспрепятствовать соответствующим контролем качества. Недостаток полусинтетического метода заключается в постоянной зависимости производства от исходного сырья - свиного инсулина. При биосинтетическом производстве человеческого инсулина необходимый геномный материал переносят в микроорганизмы, которые начинают синтезировать предшественники инсулина.

Технология:

Свежие или замороженные ткани железы измельчают на мясорубке-волчке и экстрагируют способом бисмацерации в эмалированном реакторе с мешалкой. В качестве экстрагента для первичной мацерации используют 80-85% этанол, для второй – 57% этанол, подкисленной кислотой (ортофосфорной, серной, хлороводородной) до рН 2,8-3,0. Экстракцию проводят 1,5 -4 ч при перемешивании. Экстракты отделяют фильтрованием или центрифугированием, объединяют и проводят очистку.

Предварительная, грубая очистка экстракта одинакова по всем технологиям, она сводится к удалению анионов кислот. Анион ортофосфорной кислоты удаляют раствором кальция хлорида при рН 3,3 – 3,8. Затем осуществляют депротеинизацию – последовательное отделение балластных белковых веществ при рН 4,5 – 5,1 и 3,5 при температуре 0^оС. Выпадающие осадки отделяют центрифугированием. Прозрачный экстракт концентрируют на вакуум – дистилляционной установке пленочного типа при температуре не выше 30^оС до содержания этанола 10-25% в возможно более короткий срок, при строгом соблюдении температурного режима.

Концентрированный осадок очищают от липидов и балластных белков отстаиванием на холоду (0-4^оС) при значении рН 3,0-3,3. От всплывшего слоя липидов и осадка балластных белков экстракт отделяют фильтрованием. Из сгущенного очищенного экстракта инсулин – сырец выделяют двухкратным высаливанием 25% раствором натрия хлорида или 40% раствором аммония сульфата.

При получении полусинтетического инсулина производится замена аминокислоты аланина в 30 позиции В-цепи свиного инсулина на треонин, находящийся в этом положении в человеческом инсулине. В полусинтетическом инсулине присутствуют в небольшом количестве примеси соматостатина, глюкагона, панкреатических полипептидов.

Биосинтетический инсулин не имеет этих примесей и обладает меньшей иммуногенностью. При его производстве в клетку пекарских дрожжей или E.coli генно-инженерным способом вводится рекомбинантная ДНК, содержащая ген человеческого инсулина. В результате дрожжи либо бактерии начинают синтезировать человеческий инсулин. Человеческие генно-инженерные инсулины являются лучшими инсулинами, которые должны иметь преимущество при выборе препарата для лечения.

± Охарактеризуйте способы очистки: ионный обмен, электрофорез, аффинная хроматография и др.

Наиболее прогрессивным способом выделения инсулина является ионообменная хроматография. По этому способу исключают операцию упаривания, а осуществляют сорбцию инсулина из экстракта, частично освобожденного от балластных веществ на макропористом сульфокатионите при значении рН 3,0 – 3,3 в режиме псевдосжижения. Для удаления жира катионит промывают 65-67% этанолом, а для удаления балластных белков – 0,3 М раствором ацетатного буфера. Десорбцию инсулина проводят 0,01 – 0,05 М раствором аммонийного буфера. Инсулин неустойчив в щелочной среде, поэтому десорбируют его быстро, элюат немедленного подкисляют кислотой хлороводородной до рН 4,1 – 4,5 и добавляют ацетон. Осадок балластных веществ удаляют. Инсулин осаждают в виде цинк-инсулина раствором цинк ацетата, очищают кристаллизацией.

Цинк – инсулин растворяют в воде, подкисленной лимонной кислотой до рН 2,6 – 2.8. раствор отстаивают, выпавший осадок балластных белков удаляют фильтрованием. Фильтрат смешивают с ацетоном, добавляют цинк хлористый и фенол, охлаждают до 0⁰С, создавая условия для медленной кристаллизации инсулина. Раствор подщелачивают до рН 8,0 – 8,5, оставляют на пару минут, создают рН 6,7 – 6,8 и перемешивают 1 ч. При значении рН 6,5 перемешивают 2 ч и отстаивают 18-20 ч, при рН 6,2 – 6,0 перемешивают 2 ч, при рН 5,8 – также 2 часа и отстаивают 48-96 ч при температуре 5^оС. Выпавшие кристаллы инсулина отделяют центрифугированием, промывают на воронке Брюхнера ледяной водой дистиллированной, ацетоном и эфиром. Досушивают инсулин на воздухе, в вытяжном шкафу, эксикаторе.

Дополнительную очистку инсулинов производят ионообменной хроматографией на макропористом анионите и повторной перекристаллизацией.

Для очистки также возможно использование метода электрофореза. Электрофорез - это один из видов направленных движений заряженных частиц коллоидных систем в жидкой среде под действием внешнего электрического поля. Наиболее широкое распространение нашли электрофоретические методы с использованием инертных носителей (бумаги, гелей и др.), получившие общее название зонального электрофореза, т. к. фракции разделяемых веществ образуют в толще носителя отдельные, несмешивающиеся зоны. Электрофорезчасто сочетают с другими методами разделения биоорганических соединений (например, с хроматографией). Разработана техника концентрирования электрофоретических зон биополимеров в гелях, значительно повышающая разрешающую способность метода (диск-электрофорез).

Аффинная хроматография (также как и предыдущий метод) используются для очистки инсулина в основном полученного биосинтетическим путем из свиного инсулина.

Аффинная хроматография - метод очистки и разделения белков, основанный на их избирательном взаимодействии с лигандом, ковалентно связанным с инертным носителем. В качестве лигандов используют соединения, взаимодействие которых с разделяемыми веществами основано на биологической функции последних. Главная особенность, которая обусловливает высокую эффективность А.х., состоит в том, что разделение основано на различии не физ.-хим. признаков молекулы (заряда, формы и размера), а специфических функциональных свойств, отличающих данный вещество от множества других биополимеров.

Разделение в А. х. обычно проводят на хроматографических колонках; иногда разделяемую смесь помещают в сосуд с сорбентом и выдерживают до полного связывания исследуемого компонента. Затем сорбент (в колонке или сосуде) промывают буферным раствором для удаления несвязавшихся веществ, после чего десорбируют исследуемый компонент. Десорбция (элюция) последнего обычно достигается повышением ионной силы, изменением рН буферного раствора или добавлением в него органического растворителя, что ослабляет взаимодействие лиганд - фермент. Более избирательна десорбция раствором лиганда.

Для разделения инсулинов применяется также ряд других аналогичных методов. Т. наз. ковалентная хроматография основана на избирательном образовании и последующем расщеплении ковалентных связей между выделяемым веществом и носителем, напр. между белком с SH-группами и ртуть-органическим производными агарозы. Применяется также лигандообменная хроматография, при которой ферменты связываются через функциональный ион металла с комплексоном, иммобилизованным на носителе.

Получила распространение гидрофобная хроматография, при которой сорбент (напр., фенилсефароза), содержащий гидрофобные группировки, вкрапленные в гидрофильную матрицу, взаимодействует с гидрофобными участками, содержащимися на поверхности белков. Нередко при этом наблюдаются также ионообменные взаимодействие, как, например, при использовании в качестве сорбента алкиламиносефароз.

Избирательное выделение гликопротеинов обеспечивают иммобилизованные на носителях лектины - белки, специфически взаимодействующие с концевыми моносахаридными звеньями углеводных цепей. Иммобилизованные субъединицы ряда белков с четвертичной структурой м. б. использованы для извлечения этих белков из сложных смесей вследствие специфических межсубъединичных контактов.

± Какое влияние технология получения инсулина может оказывать на терапевтическую активность препарата?

От технологических особенностей зависят:

- биодоступность

- степень очистки и как следствие частота и серьезность возможных побочных эффектов, особенно возникновения аллергических реакций

- устойчивость ЛП со временем

- срок годности

± Какие технологические приемы определяют степень пролонгации препаратов инсулина?

Технологические приемы:

1. Смешивание кристаллического инсулина с протамином сульфата. При контакте с тканями инсулин постепенно отделяется от протамина и снижает содержание сахара в крови.

2. Добавление цинка хлорида к инсулину – протамину. Цинка хлорид еще больше снижает скорость высвобождения инсулина

3. Смешение кристаллического инсулина с цинка хлоридом и буферным раствором. Изменяя порядок смешивания и длительность перемешивания, можно осадить 2 физические фракции инсулина: аморфную и кристаллическую. Скорость всасывания и действия введенного подкожно инсулина зависит от физической фракции ЛВ: аморфный инсулин обладает быстрым и коротким действием, кристаллический медленным и долгим.

4. Смешивание аморфного инсулина с кристаллической фракцией ЛВ в различных соотношениях позволяет создать инсулины с определенным временным промежутком действия.

± Какова длительность действия инсулина при использовании названных препаратов?

± Изложите значение и роль лекарственных форм и вспомогательных веществ при изготовлении в условиях аптеки пролонгированных лекарственных форм.Приведите примеры.

Вспомогательные вещества, увеличивающие время нахождения лекарственных средств в организме, называются пролонгаторами. У лекарственных средств пролонгированного действия увеличена продолжительность действия.

При быстром выведении лекарственных веществ из организма или быстром разрушении в нем а/б, витаминов, гормонов и др. возникает необходимость частого введения лекарственных веществ, что приводит к изменению концентрации их в организме и обусловливает нежелательные побочные явления (аллергические реакции, раздражение и т.п.). Необходимо создание лекарственных препаратов, однократный прием которых, сохраняя бы в организме в течение длительного времени терапевтически активную концентрацию лекарственного вещества, в том числе поступление лекарственного вещества с заданной скоростью.

Пролонгирующим компонентам, помимо требований, предъявляемых к вспомогательным веществам, следует отнести и поддержание оптимального уровня лекарственного вещества в организме, отсутствие резких колебаний его концентрации. Максимум концентрации лекарственного вещества в крови прямо пропорционально введенной дозе, скорости всасывания и обратно пропорционально скорости выделения вещества из организма.

Существуют различные технологические методы пролонгирования ЛП: повышение вязкости дисперсионной среды (заключение лекарственного вещества в гель); заключение лекарственного вещества в пленочные оболочки; суспендирование растворимых лекарственных веществ; создание глазных лекарственных пленок вместо растворов и др.

Наиболее предпочтительным является заключение лекарственного вещества в гель или использование в качестве дисперсионной среды неводных растворителей (ПЭО - 400, масла и др.). В качестве геля для пролонгированных ЛП чаще используют растворы ВМС различной концентрации, что позволяет регулировать время пролонгирования. К таким веществам относятся МЦ, КМЦ и натрий КМЦ (1%), ПВП, коллаген и др. ВМС. (пример - глазные капли в виде 10% раствора сульфацил - натрия, пролонгированные 1% МЦ).