Молекулярный механизм репликации ДНК у эукариот и прокариот.

1. Репликация бактериальных и вирусных кольцевых геномов начинается с определенной точки и идет в противоположных направлениях, т.е. у бактерий и вирусов существует одна точка начала репликации ( ori ) и две репликационные вилки. Реплицирующаяся хромосома напоминает по структуре греческую букву θ (тетта). По завершении репликации θ-типа образуются две кольцевые молекулы. 2. У некоторых вирусов и при амплификации ДНК генов рРНК в оогенезе у амфибий в одной цепи их кольцевой хромосомы происходит разрыв фосфодиэфирной связи. Затем к свободному 3’-концу разорванной цепи начинают присоединяться нуклеотиды, эта цепь растет, а кольцевая цепь служит матрицей. По мере роста разорванной цепи ее 5’-конец постепенно смещается, и начинается построение цепочки, комплементарной этому участку. Образующаяся структура похожа на греческую букву σ (сигма). Такой тип репликации называют «катящимся кольцом» или σ-типом. Вновь синтезированный «хвост» в определенных точках разрезается, и по завершении одного цикла репликации образуется одна кольцевая молекула и одна линейная. Длина образующегося «хвоста» иногда может в несколько раз превышать длину окружности кольцевой молекулы.

3. Линейные хромосомы (у некоторых вирусов и эукариот) начинают реплицироваться в одной или нескольких точках, две вилки репликации движутся в противоположных направлениях. По завершении репликации образуются две линейные молекулы.

32 .МеханизмырепарацииДНКиихкраткаяхарактеристика.

Процесс восстановления исходной нативной структуры ДНК называют репарацией ДНК, или генетической репарацией, а системы, участвующие в нем – репарационными. Репарация ДНК – один из важнейших генетических процессов в клетке, обеспечивающих ее жизнеспособность и сохранение вида в целом.

Эксцизионная репарация обеспечивает вырезание неверного или поврежденного нуклеотида/участка ДНК, последующую синтез застройку бреши и лигирование. Пострепликативная репарация осуществляется в тех случаях, когда повреждение доживает до фазы репликации (слишком много повреждений, или повреждение возникло непосредственно перед репликацией) или имеет такую природу, которая делает невозможным его исправление с помощью эксцизионной репарации (например, сшивка цепей ДНК).

33. Система рестрикции-модификации и ее биологическое значение .

В молекулах ДНК, полученных из разных источников, встречаются модифицированные основания, например, 5-метилцитозин, 6-метиламинопурин и др. Они не включаются в ДНК при репликации как таковые, а появляются в результате ферментативной модификации синтезируемых молекул, начиная со стадии фрагментов Оказаки. При этом модифицируются основания, занимающие определенное положение в молекуле. Эти реакции осуществляют ферменты, представляющие собой часть единой системы рестрикции-модификации. Модификация определенных оснований предохраняет ДНК от разрушения рестриктирующими эндонуклеазами, которые имеют сродство к тем же последовательностям нуклеотидов, что и ферменты модификации.

Система рестрикции-модификации – это своеобразный барьер, охраняющий клетку от включения в ее генетический материал чужеродных молекул ДНК. Возникновение мутантов, лишенных способности к рестрикции, открывает дополнительные возможности для изменчивости за счет ассимиляции клеткой чужеродной генетической информации.

34. Молекулярный механизм транскрипции у эукариот.

Инициация транскрипции начинается с присоединения σ-субъединицы к участку ДНК, который называется промотором, выполняющему функцию присоединения и ориентации РНК-полимеразы на матрице ДНК. Сам синтез РНК начинается за промотором на расстоянии 6-7- оснований и первый нуклеотид с 5’-конца подвергается модификации (метилированию гуанина), называемой кэпированием. Именно поэтому стартовая точка гена (первый нуклеотид) является кэп-сайтом. На данном этапе образуется инициаторный комплекс, в структуру которого входят специальные инициаторные белки (общие факторы транскрипции) помимо РНК-полимеразы.

Элонгация связана с отделением σ-субъединицы от транскрипционного комплекса, куда входят РНК-полимераза. ДНК-матрица и синтезирующая цепь РНК. РНК-полимераза локально расщепляет двойную спираль ДНК. Между новосинтезированной РНК и матричной ДНК образуются временные гибридные участки двойной спирали ДНК-РНК, включающие 15-20 пар нуклеотидов. Это способствует более точному считыванию цепи ДНК.

Терминация транскрипции РНК характеризуется взаимодействием белкового стоп-сигнала вблизи 3’-конца гена с РНК-полимеразой, что способствует замедлению транскрипции, а затем фермент катализирует синтез последовательности ААУААА, которая блокирует 3’-конец мРНК. Последующий синтез 15 нуклеотидов завершает работу РНК-полимеразы. При отделении транскрипта от матрицы экзонуклеаза отщепляет последние 15 нуклеотидов, а фермент поли(А)-полимераза способствует достраиванию к последовательности ААУААА около 150-200 полиадениловых нуклеотидов (полиА), которые необходимы для транспорта мРНК из ядра, так как в цитоплазме они отщепляются.

Процессинг РНК или созревание связано с модификациями новосинтезированных РНК, сошедших с ДНК матрицы путем гидролиза или присоединением нуклеотидов к концевым группам или метилированием.

Сплайсинг РНК – это сложный двухступенчатый процесс, осуществляемый макромолекулярным комплексом (сплайсомой), в ходе которого из мРНК вырезаются интроны (вставки, не имеющие смыслового значения) и сшиваются экзоны (последовательности генов). Сплайсома состоит из пяти типов ядерных РНК и 50 типов белков. Она комплементарно соединяется на границе экзон-интрон. Вырезание интронов осуществляет РНК, а сшивание экзонов – РНК-лигазы.

35.Молекулярный механизм транскрипции у прокариот.

Инициация транскрипции начинается с присоединения σ-субъединицы к участку ДНК, который называется промотором, выполняющему функцию присоединения и ориентации РНК-полимеразы на матрице ДНК. Сам синтез РНК начинается за промотором на расстоянии 6-7- оснований и первый нуклеотид с 5’-конца подвергается модификации (метилированию гуанина), называемой кэпированием. Именно поэтому стартовая точка гена (первый нуклеотид) является кэп-сайтом. На данном этапе образуется инициаторный комплекс, в структуру которого входят специальные инициаторные белки (общие факторы транскрипции) помимо РНК-полимеразы.

Элонгация связана с отделением σ-субъединицы от транскрипционного комплекса, куда входят РНК-полимераза. ДНК-матрица и синтезирующая цепь РНК. РНК-полимераза локально расщепляет двойную спираль ДНК.

Между новосинтезированной РНК и матричной ДНК образуются временные гибридные участки двойной спирали ДНК-РНК, включающие 15-20 пар нуклеотидов. Это способствует более точному считыванию цепи ДНК. По мере движения фермента в направлении 5’-3’ вдоль цепи ДНК происходит отхождение цепи РНК и восстановление водородных связей между нуклеотидами ДНК.

Терминация транскрипции РНК характеризуется взаимодействием белкового стоп-сигнала вблизи 3’-конца гена с РНК-полимеразой, что способствует замедлению транскрипции, а затем фермент катализирует синтез последовательности ААУААА, которая блокирует 3’-конец мРНК. Последующий синтез 15 нуклеотидов завершает работу РНК-полимеразы. При отделении транскрипта от матрицы экзонуклеаза отщепляет последние 15 нуклеотидов, а фермент поли(А)-полимераза способствует достраиванию к последовательности ААУААА около 150-200 полиадениловых нуклеотидов (полиА), которые необходимы для транспорта мРНК из ядра, так как в цитоплазме они отщепляются.

Процессинг РНК или созревание связано с модификациями новосинтезированных РНК, сошедших с ДНК матрицы путем гидролиза или присоединением нуклеотидов к концевым группам или метилированием. Так, для мРНК модификации связаны с присоединением нуклеотидов (полиА) к 3’-концу и образованием кэпа путем присоединения 7-метилгуанозина на 5’-конце.

Сплайсинг РНК – это сложный двухступенчатый процесс, осуществляемый макромолекулярным комплексом (сплайсомой), в ходе которого из мРНК вырезаются интроны (вставки, не имеющие смыслового значения) и сшиваются экзоны (последовательности генов). Сплайсома состоит из пяти типов ядерных РНК и 50 типов белков. Она комплементарно соединяется на границе экзон-интрон. Вырезание интронов осуществляет РНК, а сшивание экзонов – РНК-лигазы.

36. Процесс трансляции у эукариот.

Трансляция протекает в пять этапов:

Активация аминокислот . На этом этапе, который протекает не в рибосоме, а в цитозоле, каждая из 20 аминокислот ковалентно присоединяется к определенной тРНК, используя для этого энергию АТФ. Эти реакции катализируются группой требующих присутствия ионов магния активирующих ферментов, каждый из которых является специфическим по отношению к одной из аминокислот и к соответствующей этой аминокислоте тРНК.

Инициация полипептидной цепи . На этом этапе мРНК, содержащая информацию о данном полипептиде, связывается с малой (40 S ) субъединицей рибосомы, а затем и с инициирующей аминокислотой, прикрепленной к соответствующей тРНК (метионил-тРНК); в результате образуется инициирующий комплекс. тРНК, несущая инициирующую аминокислоту, взаимодействует по принципу комплементарности с находящимся в составе мРНК особым триплетом, или кодоном, который сигнализирует о начале полипептидной цепи (АУГ).

Осуществлению этого процесса, который требует присутствия ГТФ и ионов магния способствуют специфические факторы инициации ( eIF -1, eIF -2, eIF 2 A , eIF -3, eIF -4 A , eIF -4 B , eIF -4C, eIF -4 D и кэп-узнающий фактор).

Элонгация . Далее полипептидная цепь удлиняется за счет последовательного ковалентного присоединения аминоксилот, каждая из которых доставляется к рибосоме (80 S ) и встраивается в определенное положение с помощью соответствующей тРНК, образующей комплементарные пары с отвечающим ей кодонов в мРНК. Элонгация осуществляется при помощи факторов элонгации ( eEF -1 α , eEF -1 βγ и eEF 2). Для связывания каждой поступающей аминоацил-тРНК и для перемещения рибосомы вдоль мРНК на один кодон, т.е. для удлинения растущего полипептида на одно звено, затрачивается энергия, получаемая при гидролизе двух молекул ГТФ.

Терминация и высвобождение . После завершения синтеза полипептидной цепи, о котором сигнализирует терминирующий кодон мРНК (УАА, УАГ и УГА), происходит высвобождение полипептида из рибосомы при участии особых «рилизинг»-факторов, или факторов терминации ( eRF ).

Сворачивание полипептидной цепи и процессинг . Чтобы принять свою нативную биологически активную форму, полипептид должен свернуться, образуя при этом определенную пространственную конфигурацию. До или после сворачивания новосинтезированный полипептид может претерпевать процессинг, осуществляемый ферментами и заключающийся в удалении инициирующих аминокислот, в отщеплении лишних аминокислот, в отщеплении лишних аминокислотных остатков, во введении в определенные аминокислотные остатки фосфатных, метильных, карбоксильных и других групп, а также в присоединении олигосахаридов или простетических групп.

37. Процесс трансляции у прокариот.

Трансляция протекает в пять этапов:

Активация аминокислот . На этом этапе, который протекает не в рибосоме, а в цитозоле, каждая из 20 аминокислот ковалентно присоединяется к определенной тРНК, используя для этого энергию АТФ. Эти реакции катализируются группой требующих присутствия ионов магния активирующих ферментов, каждый из которых является специфическим по отношению к одной из аминокислот и к соответствующей этой аминокислоте тРНК.

Инициация полипептидной цепи . На этом этапе мРНК, содержащая информацию о данном полипептиде, связывается с малой (30 S ) субъединицей рибосомы, а затем и с инициирующей аминокислотой, прикрепленной к соответствующей тРНК ( N -формилметионил-тРНК); в результате образуется инициирующий комплекс. тРНК, несущая инициирующую аминокислоту, взаимодействует по принципу комплементарности с находящимся в составе мРНК особым триплетом, или кодоном, который сигнализирует о начале полипептидной цепи (АУГ).