Порядок проведения исследований

Все работы по проведению исследования материала, подозрительного на наличие возбудителей особо опасных микозов, проводят с соблюдением требований СП 1.3.1285-03 «Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)».

Лабораторная диагностика особо опасных микозов требует проведения следующих этапов:

- обнаружение элементов гриба в патологическом материале;

- выделение чистой культуры из патологического материала микологическим или биологическим методами;

- обнаружение антигенов иммунологическими методами;

- выявление и идентификация ДНК грибных патогенов молекулярно-генетическими методами;

- изучение ответных реакций организма с помощью иммуно-серологических и аллергических проб.

Микроскопия и гистологическое исследование патологического материала

Coccidioides spp.

Микроскопию исследуемого материала от больных проводят чаще в препаратах по типу «раздавленной капли».  Для окраски микробиологических препаратов применяют калькофлуор белый, возможно использование 10% гидроксида калия для просветления патологического материала. Однако гриб, ввиду наличия толстой светопреломляющей оболочки, может быть виден и в нативных препаратах. Дополнительные методы окраски, как правило, применяются при гистологическом исследовании, при этом чаще всего используется гематоксилин-эозин. Иногда для четкой визуализации сферул требуются специфические виды окраски, такие как серебрение по Гомори-Грокотт и PAS-реакция. 

В патологическом материале грибы рода Coccidioides обнаруживаются в виде сферул, которые представляют собой крупные, круглые образования, напоминающие спорангии фикомицетов. Стенка их толстая, двухконтурная. Размеры сферул варьируют от 10 до 200 мкм, в среднем, 60-80 мкм. В зависимости от стадии развития сферулы могут быть пустыми или содержащими эндоспоры (2-4 мкм в диаметре).

При микроскопировании материала, полученного из окружающей среды, гриб выглядит как тонкий, септированный, ветвящийся мицелий, боковые ответвления которого дают начало одноклеточным бочковидным артроконидиям (3-4 х 3-6 мкм), чередующимся с пустыми клетками-дизъюнкторами.

5.1.2H . capsulatum

Микроскопическое исследование патологического материала в диагностике гистоплазмоза имеет вспомогательное значение ввиду отсутствия специфических признаков тканевой формы возбудителя. Гриб в патологическом материале имеет вид мелких (2-3 мкм в диаметре) почкующихся клеток овальной или яйцевидной формы. Почки (2-3) располагаются, как правило, по полюсам родительской клетки. После обработки патологического материала по общим правилам, с целью его просветления, готовят препарат по типу «раздавленной капли» и просматривают в микроскопе под иммерсией. Однако ввиду малых размеров тканевой фазы возбудителя и его внутриклеточного расположения, гриб в неокрашенных препаратах обнаруживают редко. Исключением является материал, взятый со стенок каверн, в которых гриб находится в мицелиальной фазе. В таких препаратах можно обнаружить тонкий септированный мицелий и типичные бугристые или шиповидные макроконидии размером до 10-20 мкм.

Более обнадеживающие результаты могут быть получены при исследовании материала (мазки крови, осадок спинномозговой жидкости, пунктаты печени, селезенки, лимфоузлов, костного мозга), окрашенного одним из гематологических красителей: краской Романовского-Гимза, Лейшмана, Райта, Май-Грюнвальда. При микроскопии гриб виден в цитоплазме фагоцитов в виде мелких базофильных телец, окруженных бесцветным ореолом, который раньше принимали за капсулу.

5.1.3 B . dermatitidis

При микроскопическом исследовании патологического материала следует обращать внимание на почкующиеся клетки, для которых характерна прочная связь между родительской и дочерней клетками с помощью широкого основания. Фактически может появляться вторая и третья почки до того как отделится первая, так что иногда можно видеть глыбки из 1-4 клеток. От грибов рода Candida возбудитель бластомикоза отличается большей величиной клеток и отсутствием псевдомицелия, от возбудителя паракокцидиоидомикоза – отсутствием почкообразования в виде "короны", от воз­будителя кокцидиоидомикоза – отсутствием сферул, от возбудителей актиномикоза -  отсутствием друз.

При кожной форме вскрывают милиарный абсцесс и острым скальпелем выдавливают каплю гноя. Смешивают его с равным коли­чеством 10-15% гидроксида натрия или калия на предметном стек­ле, накрывают покровным стеклом и исследуют под малым и большим увеличением микроскопа. Внешний вид гриба в дрожжевой фазе, в том числе и в патологическом материале, описан выше.

Для лабораторной диагностики легочной формы собирают мокроту утром натощак после туалета полости рта. Материал иссле­дуют сразу же. Клетки гриба настолько крупные и заметные, что их окраска не является обязательной. При невозможности немедленной микроскопии фиксированные мазки окрашивают обычными методами по Граму, Романовскому - Гимзе, Райту, Мак-Манусу и др.

5.1.4 P . brasiliensis

Образцы гноя и отделяемого, обработанные раствором КОН, подвергают микроскопическому исследованию для обнаружения дрожжеподобных клеток с тонкой оболочкой, окруженных множеством почкующихся клеток с суженным основанием, что напоминает корабельный штурвал или корону – признак патогномоничный для паракокцидиоидомикоза. 

Тканевые формы видны при окраске гематоксилином и эозином, но более демонстративны при PAS-окраске и импрегнации по Гомори-Грокотт.