Культуральный (микологический) метод

5.2.1 Coccidioides spp .

Микологическое исследование является самым важным этапом лабораторной диагностики кокцидиоидомикоза. Успех культурального исследования  определяется наличием в исследуемом материале жизнеспособных элементов гриба, степенью его микробного загрязнения и качеством питательных сред. Для выращивания мицелиальной фазы гриба применяют агар Сабуро с 1-1,5 % дрожжевого экстракта (или аутолизата) и 4 % глюкозы. В среду добавляют антибактериальные антибиотики широкого спектра действия, чаще левомицетин (хлорамфеникол) – 0,05 мг на 1 мл среды, а также актидион (циклогексимид) – 0,1-1,0 мг на 1 мл среды, который подавляет рост посторонних грибов, но не влияет на рост Coccidioides spp.

Начало роста на плотных средах отмечается на 3-4 дни после посева, а формирование артроспор – на 5-7-10 сутки в зависимости от индивидуальных особенностей штаммов. На жидких питательных средах рост более интенсивный, но формирование типичных артроспор происходит позднее.

По характеру роста культуры Coccidioides spp .  мало чем отличаются от ряда других нитчатых грибов: рыхлый, местами высокий или редкий пушистый мицелий серовато-белого цвета, иногда желтоватый или светло-коричневый с мучнистым налетом. Это ориентировочные признаки для отбора колоний подозрительных культур.

После выявления на средах зрелой грибницы посевы с плотной среды заливают стерильным 0,85 % раствором NaCl при помощи шприца с длинной иглой (для предупреждения распыления артроспор). Из взвеси готовят мазок по типу «раздавленной капли».

Наличие артроспор типичной бочонкообразной, квадратной или цилиндрической формы с клетками – разобщителями («усами») является важным признаком для идентификациикультур Coccidioides spp. Однако следует помнить о наличии морфологически сходных сапрофитических грибов, которые, однако, не патогенны для млекопитающих и не образуют сферул.

Набор сред для выделения и идентификации культур Coccidioides spp .  ограничен следующими: а) агар Сабуро (эта же среда может быть использована и для хранения музейных культур возбудителя при 4 ⁰С в течение 3-6 мес), бульон Сабуро; б) среда Чапека-Докса. Эта среда рекомендуется для длительного хранения музейных штаммов Coccidioides spp ., так как на ней сохраняются типичные морфологические свойства, присущие всем штаммам этого гриба.

5.2.2 H . capsulatum

Патологический материал после обработки антибиотиками (если материал нестерилен) засевают на среды, используемые отдельно для выращивания мицелиальной (агар Сабуро, сусло-агар, мясо-пептонный) и дрожжеподобной (сердечно-мозговой агар, среда Френсиса) фаз. Посевы инкубируют при 28 ⁰С и

37 ⁰С в течение 30 и 10 сут соответственно. Выросшие культуры микроскопируют с целью обнаружения типичных морфологических элементов гриба. При одновременном выделении мицелиальной и тканевой форм возбудителя диагноз гистоплазмоза становится несомненным. Для его окончательного подтверждения пробирку с выросшей тканевой формой дополнительно инкубируют при пониженной температуре (26-28 ⁰С). Гриб в течение 7-14 дней конверсирует из дрожжеподобной в мицелиальную фазу. При получении только мицелиальной фазы возбудителя ее пересевают на агар Френсиса и выращивают при 37 ⁰С 7-10 сут с целью получения дрожжеподобной. При получении только дрожжеподобной фазы снижают температуру инкубации до 28 ⁰С – для получения мицелиальной.

5.2.3 B . dermatitidis

Посевы материала производят как на углеводные среды — агар Сабуро, сусло-агар, так и на мясо-пептонные с добавлением глюкозы (1-2%) или крови. Для получения гриба в мицелиальной фазе посевы инкубиру­ют при температуре 20-30 °С, для дрожжевой — при 37 °С. Более надежно гриб высевается из материала, инкубированного при низких температурах. Загрязненный посторонней микрофлорой материал засевают на среды, содержащие антибиотики (пенициллин, стрепто­мицин, левомицетин, актидион). Однако антибиотики не добавляют, если посевы инкубируются при 37 °С, так как при этом рост гриба угнетается антибиотиками. B.dermatitidis растет довольно медленно и посевы должны инкубироваться до 30 сут.

5.2.4 P . brasiliensis

Гриб хорошо растет на самых разнообразных питательных средах и не требует каких-либо специальных добавок для своего культивирования. При первичном посеве используют одну и ту же питательную среду, меняя только температуру инкубации: до 30 °С – для выращивания мицелиальной формы и 37 °С - для дрожжеподобной. Основная задача культивирования – это получение культуры в двух фазах с целью доказательства диморфизма возбудителя, так как в мицелиальной фазе роста гриб нельзя отличить от многих, в том числе и непатогенных для человека грибов.

Биологический метод

Заражение биопробных животных применяется как для освобождения патологического материала от посторонней флоры, так и для оценки вирулентности патогена.

Взвесь испытуемой культуры или патологического материала (0,5-1,0 мл) вводят внутрибрюшинно белым мышам или интратестикулярно морским свинкам. Для предотвращения гибели животных от посторонней микрофлоры к исследуемому материалу рекомендуется добавить антибиотики, выдержать смесь в термостате при 37 °С в течение часа, а затем уже ввести животным. Обработка биопробных животных кортикостероидами (внутримышечно или подкожно по 1,5 мг в течение 6 дней) существенно снижает их резистентность.

На каждый образец патологического материала берут по 4 животных.Вскрытие животных проводят через 2 и 4 недели.

При наличии грибов рода Coccidioides в исследуемом материале, сферулы в органах зараженных животных можно идентифицировать как с помощью обычной, так и люминесцентной микроскопии за счет способности сферул светиться в сине-фиолетовых лучах (аутофлуоресценция). Единственным надежным критерием для подтверждения микотической природы сферул является их прорастание. Наилучшие условия для быстрого прорастания сферул (в первые 24 ч) создаются в раздавленных и запарафинированных по краю покровного стекла каплях изотонического раствора хлорида натрия с содержанием пенициллина и стрептомицина по 200 ЕД/мл при температуре инкубации 37 ⁰С. В первые 2-16 ч прорастают свободно лежащие эндоспоры, через 16-48 ч – молодые сферулы, некоторые сферулы прорастают только через 72 ч, давая одновременно от 1 до 4-5 ростков. Наряду со сферулами в патологическом материале иногда удается обнаружить мицелий в виде коротких или длинных нитей. Такие находки возможны при исследовании смыва из каверн. При микроскопическом исследовании значение имеют лишь положительные результаты (обнаружение сферул), а отрицательные данные не позволяют исключить кокцидиоидную природу микоза.

Кроме того, из органов брюшной полости необходимо сделать посевы внутренних органов (печень, селезенка) на те же питательные среды. Сроки инкубации и порядок учета результатов аналогичны описанным для микологического метода исследования. Для оценки вирулентности возбудителя целесообразно посеять и кусочки легких, так как находки гриба в них свидетельствует о диссеминации. Выросшую культуру микроскопируют, как описано выше.

Точный диагноз гистоплазмоза основан на выделении и идентификации грибов в культуре или обнаружении типичных внутриклеточно расположенных элементов дрожжевой фазы в тканях, однако для подтверждения диагноза следует добиться конверсии мицелиальной формы с типичной микроскопической структурой, то есть с бугорчатыми макроконидиями и гладкостенными микроконидиями – в дрожжеподобную. Для получения конверсии in vitro  мицелий тщательно растирают в ступке с физиологическим раствором. Эту взвесь засевают в несколько пробирок с агаром Фрэнсиса, которые инкубируют при

37 ⁰С. Для получения чистой культуры в дрожжевой фазе иногда приходится делать от 2 до 5-6 пересевов на ту же среду. Идентификация дрожжевой фазы производится получением конверсии ее в мицелиальную, для чего применяется инкубация при 25-30 °С на агаре Сабуро с фосфорнокислыми солями или на картофельном агаре с 2 % глюкозы и изучение патогенности для биопробных животных с повторным получением чистой культуры гриба в двух фазах.  

При диагностике бластомикоза биологический метод имеет меньше преимуществ перед получением культуры, чем при кокцидиоидомикозе или гистоплазмозе. B . dermatitidis патогенен для мышей, но в сроки от 3-4 недель в брюшной полости образуются только мелкие абсцессы без генерализации заболевания. Мышей забивают через 3-4 недели, исследуют гной и делают его посев из любых мелких абсцессов, найденных в брюшной полости. Они обычно бывают в сальнике, вблизи поджелудочной железы и часто припаиваются к брюшине, печени, селезенке или находятся в области таза. Патогистологическое исследование для диагностики бластомикоза используется редко, так как оно не имеет никаких преимуществ перед микроскопией и получением культуры в чистом виде.

P . brasiliensis не является высоко патогенным для лабораторных животных, поэтому биологический метод диагностики паракокцидиоидомикоза используется чаще в научных, нежели в практических целях.