ОСНОВЫ КЛИНИЧЕСКОЙ ИММУНОЛОГИИ

●

Иммунология как наука изучает закономерности генетических, клеточных и молекулярных ответных реакций организма на анти­гены — микроорганизмы, генетически чужеродные ткани, клетки метаболиты чужеродных клеток (белки, нуклеопротеиды, полиса­хариды и др., в том числе синтезированные искусственно), а также аутоантигены, образующиеся в собственном организме при пато­логических состояниях, осуществляемые иммунной системой организма.

Иммунная система ответственна за защиту организма от пара­зитов, бактерий, вирусов, элиминацию мутированных и отмираю­щих клеток, противораковую устойчивость. Иммунные реакции лежат в основе несовместимости и отторжения донорских органов и тканей. При извращении функции иммунной системы развива­ются аутоиммунные болезни, аллергии, некоторые болезни анте­натального периода, канцерогенез, преждевременное старение, снижение толерантности к заразным, в том числе условно-пато­генным болезням.

Особую актуальность в ветеринарии на современном этапе приобретает проблема борьбы со злокачественными заболевания­ми, особенно системы крови (гемобластозами — лейкозами, ретикулезами крупного рогатого скота). Организм большинства мле­копитающих состоит из 10¹²—10¹³ генетически идентичных клеток, а частота их мутаций близка к 1 на 1 млн, т. е. в организме по­стоянно образуется около 10 млн изменившихся в генетическом отношении (аномальных) клеток. При этой частоте мутаций (10^-6) вероятность ее в одном тысячеклсточном организме близка к 10^-3 Таким образом, существует вероятность «генетической полом­ки», равная 1 из 1 тыс.: 999 особей из 1000 будут жить нормально а одна заболеет или погибнет, если иммунная система не справит­ся со своей задачей. Такой формальный расчет показывает, на­сколько важны объективная качественная и количественная оцен­ка функционального состояния иммунной системы, разработка методов ее тестирования, стимуляции, равно как и ингибиции (особенно при пересадке донорских органов и тканей).

Защита организма от экзогенных и эндогенных факторов, не­сущих в себе признаки генетической чужеродности генома, центральное звено которой — распознавание «своего» и «чужого», яв­ляется сущностной функцией иммунитета.

Иммунологическую функцию в организме выполняет специ­альная система клеток, тканей и органов, центральным звеном ко­торой являются лимфоциты. Вся иммунная система есть совокуп­ность лимфоидных органов и скоплений лимфоидных клеток. Лимфоидная система представляет собой ее морфологический си­ноним и включает вилочковую железу (тимус), селезенку, лимфо­узлы, пейеровы бляшки (групповые лимфатические фолликулы) и другие лимфоидные скопления, лимфоциты костного мозга и пе­риферической крови. Общее число лимфоидных клеток в орга­низме близко к 10¹². Совместно с макрофагами они осуществляют основные формы иммунологического ответа, в том числе и преж­де всего выработку антител и накопление сенсибилизированных лимфоцитов, распознающих и элиминирующих антигенные суб­станции.

В связи с этим важно правильно понимать биологическую сущ­ность иммунологической реактивности и неспецифических фак­торов защиты (резистентности). Основной задачей иммунологи­ческой реактивности является специфическая блокада, нейтра­лизация, разрушение или элиминация именно тех субстанций, которые стимулируют иммунный ответ. Неспецифического иммунного ответа, как и неспецифической иммунологической реак­тивности, не существует.

Вместе с тем сопротивляемость организма инфекциям зависит также от непроницаемости защитных барьеров (кожи, слизистых оболочек) для большинства микроорганизмов, их бактерицидности, рН в пищеварительных органах, ферментативной активности (лизоцим, пропердин и др.), экскреции некоторых микроорганиз­мов (вирусов через почки), активности и количества фагоцитов в крови и тканях, составляющих общую неспецифическую защиту организма, не могущих называться неспецифической иммуноло­гической реактивностью как не несущих на себе специального ре­агирования. Кожа и слизистые оболочки непроницаемы независи­мо от наличия контаминации их микроорганизмами; бактерицидность их зависит от кислотности и химических превращений пе-роксида водорода и не зависит от микробного загрязнения. Эти и другие неспецифические факторы защиты не изменяются под воздействиями антигенов и, таким образом, не относятся к им­мунологической реактивности, составляя сущность резистент­ности.

В настоящее время выделяется 6 типов специфических реак­ций, составляющих сущность иммунологической реактивности: 1) выработка антител; 2) гиперчувствительность немедленного типа; 3) гиперчувствительность замедленного типа; 4) иммуноло­гическая толерантность; 5) иммунологическая память и 6) идиотипическое взаимодействие. Кроме того, своеобразное место занимают аллогенная ингибиция, инактивация несингенных стволо­вых клеток и противоопухолевая активность естественных килле­ров. Эти феномены относятся к категории первичного распозна­вания «своего» и «чужого» — торможения размножения генетичес­ки чужеродных клеток.

Основные неспецифические факторы защиты и специфичес­кие формы реагирования, составляющие иммунную реактивность, по Р. В. Петрову следующие:

Антигены.Субстанции, несущие признаки генетической чужеродности, при введении которых в организме возникают специ­фические иммунные реакции, называются антигенами. Антигенность присуща белкам, многим полисахаридам, полипептидам, липополисахаридам, а также некоторым искусственным высокомолекулярным соединениям, несущим на себе специфический от­печаток чужеродное™ организму, причем их минимальная моле­кулярная масса должна быть более 10 000 Д.

Для антигенов свойственны: чужеродность; антигенность; иммуногенность и специфичность. Антигены, возникающие вслед­ствие присоединения к белковой молекуле группы, обеспечиваю­щей новую иммунологическую специфичность (антигенной де­терминанты), называются конъюгированными.

Иммунологическая специфичность антигенов определяется аминокислотным составом и их последовательностью в первич­ной полипептидной цепи; их концевыми аминокислотами; повер­хностными антигенными детерминантами, которые играют ос­новную роль в иммунологической специфичности антигенов. Крупные белковые молекулы несут на себе по нескольку детерми­нант антигенности, определяя их антигенную «валентность». Липиды и стероиды неантигенны.

Выделяют несколько видов антигенной специфичности: 1) ви­довая специфичность, по которой особи одного вида животных отличаются от особей другого; 2) групповая специфичность обус­ловливает различия среди особей одного вида; 3) типоспецифич-ность, имеет отношение к дифференциации микробных видов (возбудители ботулизма, например по характеру своего токсина, делятся на типы А, В, С, Д и Е); 4) гетероспецифичность и гетероантигены — общие для животных разных видов антигенные комп­лексы или детерминанты (например, антиген Форсмана имеется в эритроцитах лошадей, овец, собак, кошек, кроликов, крыс, уток — генетически удаленных видов); 5) функциональная специ­фичность (белки, выполняющие разные функции, альбумины, глобулины иммунологически неидентичны); 6) стадия специфичности — понятие, возникшее в познании иммунологии эмбриоге­неза (на разных стадиях эмбриогенеза в тканях появляются анти­гены, отсутствующие ранее, и их нет в тканях взрослого организ­ма); 7) гаптеноспецифичность, обусловленная гаптенной группи­ровкой.

Новую антигенную специфичность могут приобретать комп­лексы белков с некоторыми лекарственными веществами, высту­пающими в роли гаптенов (лекарственные аллергии). Особо выде­ляется также патологическая специфичность, например «ожого­вые», «раковые», «лучевые» и другие антигены.

Антитела.Это белки класса иммуноглобулинов, синтез которых стимулируется в ответ на парентеральное введение антигена и способные специфически взаимодействовать с ним.

Известны 5 классов иммуноглобулинов: IgМ, IgG, IgА, IgЕ и IgD, суммарное содержание которых в сыворотке крови около 2,5 % (по сухому остатку), т. е. не более 1/3 общего белка сыворот­ки. Они вырабатываются лимфоидными клетками.

IgА способны выходить за пределы слизистых оболочек (в ки­шечник, дыхательные пути) и составляют «первую линию оборо­ны» организма. Сыворотка иммунизированного животного, со­держащая антитела, называется иммунной, или антисывороткой.

Специфическое взаимодействие антител с антигенами, против которых они возникают, проявляется в виде ряда следующих фе­номенов, которые могут наблюдаться в лабораторных условиях.

Агглютинация состоит в том, что бактерии, соматические клет­ки и другие корпускулярные антигены во взвеси под влиянием ан­тител склеиваются между собой. Она наблюдается, например, если эритроциты барана ввести в сыворотку других животных. Склеивание микробов или эритроцитов в сыворотке животных других видов есть проявление прямой агглютинации.

В практике часто используют не прямую, а пассивную агглюти­нацию (при работе с растворимыми антигенами—альбуминами, полисахаридными антигенами и др.). При этом антиген предвари­тельно присоединяется к корпускулярному носителю — таннированным эритроцитам, частицам латекса, окиси бария и др., добав­ление к которым антител приводит к их агглютинации. Эта реак­ция характеризуется высокой чувствительностью при малых тит­рах антител.

Преципитация проявляется укрупнением антигенных субстан­ций под воздействием антител и помутнением прозрачных сред в связи с агрегацией растворенных частиц. В зависимости от усло­вий постановки и учета реакции антиген — антитело они получи­ли различное наименование.

Реакция кольцевой преципитации возникает, когда на иммунную сыворотку в пробирке наслаивают прозрачный раствор антигена и на границе их соприкосновения через несколько минут или часов образуется опалесцирующее кольцо преципитации.

Иммунофлюоресценция проявляется в том, что когда к молекуле антител присоединяется флюоресцирующий краситель (изотио-ционат натрия), антигены, связанные с антителами, становятся видимыми в ультрафиолетовом свете.

Радиоиммунологический метод (конкуренции с радиоактивным антигеном) — один из самых современных, когда учет реакции ан­тиген—антитело проводят с помощью радиоизотопных («мече­ных») антител или антигенов. Измерение радиоактивности преци­питата дает возможность определить количество антител или ан­тигена в пробах.

Иммуноферментный метод по точности не уступает радиоиммунологическому, но более прост в исполнении. На стенки полистироловых пробирок сорбированы антитела против конкрет­ного антигена. В них вносят исследуемый материал, при наличии искомого антигена он соединяется с антителами. Субстрат слива­ют и в пробирку вносят антитела против этого же антигена, ме­ченные ферментом (обычно пероксидазой хрена). Меченые ан­титела присоединяются к предыдущему комплексу и остаются на стенках пробирки. Затем содержимое пробирки заменяют на смесь хромогена ортофениленадиамина с субстратом для взятого фермента — пероксида водорода. Если искомый антиген был, фермент фиксируется на стенке пробирки и разложит пероксид водорода, а освободившийся кислород окрасит хромоген в жел­тый цвет.

Метод Уанъе основан на измерении оптической плотности сы­воротки после добавления антигена (фотоколориметрически).

Феномен лизиса основан на способности некоторых антител ра­створять клетки, против которых они возникли. Эти антитела на­зываются бактериолизинами (эритролизинами, гемолизинами). Эта реакция происходит без комплемента, который в разных ко­личествах имеется в сыворотке морских свинок. Реакция сначала идет по типу агглютинации, затем к комплексу антиген—антитело присоединяется комплемент и происходит локальное растворение бактериальной оболочки, эритроцитов или других клеток.

Феномен цитотоксичности определяется антителами — цитотоксинами, лишающими клетки жизнеспособности. Живые клет­ки не прокрашиваются эозином или трипановым синим, а погиб­шие быстро воспринимают краситель (в течение 30с). Реакция протекает при наличии комплемента.

Реакция связывания комплемента (РСК) основана на этом же свойстве комплемента связываться с комплексом антиген—анти­тело. Соединяясь с одним комплексом антиген — антитело, комп­лемент не может перейти в другой, вводимый в реагирующую сис­тему после взаимодействия первого комплекса и добавленного комплемента. В качестве второго комплекса используют смесь эритроцитов барана с антителами против них.

Если первый комплекс является комплексом антиген—антитело, то свободного комплемента в реагирующей смеси не будет и гемолиз эритроцитов не возникает, а если антител в исследуемом субстрате нет, произойдет гемолиз эритроцитов. Реакция исполь­зуется при изучении противотканевых антител и аутоантител, ви­русных инфекций.

Феномен специфической задержки используют для сравнения двух изучаемых антигенов. Например, готовят иммунную сыво­ротку против мышиных эритроцитов и, чтобы узнать, нет ли в ней антител против эритроцитов крысы (родственного вида), сыворот­ку обрабатывают эритроцитами крысы. При снижении титра ан­тител имеются родственные антигены, если титр их падает — ан­тигены идентичны.

Реакция нейтрализации токсинов. Антитоксины (антитела про­тив бактерийных токсинов, змеиного яда и некоторых других) против токсинов антигенной природы, соединяясь с ними, нейт­рализуют их. Количество антитоксина в иммунной сыворотке оп­ределяется величиной минимальных смертельных доз (ЛД₁₀₀), ко­торые могут быть нейтрализованы определенным количеством сыворотки. При столбняке, например, для этого применяют стандартные антитоксические сыворотки.

Феномен опсонизации состоит в усилении фагоцитарной актив­ности нейтрофилов и макрофагов в отношении антигенов, против которых они получены. Так, активность фагоцитов относительно стафилококков усиливается после обработки лейкоцитов или их донора антистафилококковой сывороткой. Этот эффект связывал­ся с наличием специальных антител—опсонинов, но оказалось, что это лишь проявление основной функции иммуноглобулинов давать специфический комплекс антиген—антитело.

Для определения антигенных компонентов сложных биологи­ческих жидкостей и тканевых экстрактов используют реакции преципитации в агаре в виде иммунодиффузии и иммуноэлект-рофореза. При работе с токсинами и другими растворимыми ан­тигенами используют метод пассивной гемагглютинации, при определении гормонов в крови — радиоиммунологический метод и т. д.

Различные классы иммуноглобулинов по-разному реагируют с антигенами.

Специфичность иммунитета в большей степени определяется антителами. При многих инфекционных заболеваниях после выз­доровления остается пожизненный иммунитет — состояние специфической невосприимчивости к конкретной болезни. Сыворот­ка такого животного, введенная другому животному, создает со­стояние специфической невосприимчивости к конкретным возбу­дителям и токсинам — пассивный иммунитет, продолжительность которого сохраняется около 2—4 нед.

Природа антител. Антитела при электрофорезе сыво­ротки мигрируют в электрическом поле в составе γ-глобулинов, поэтому после иммунизации их количество возрастает. Считается, что возможное количество видов антител в организме более 10 тыс. По Международной классификации совокупность анти­тел, ранее называвшаяся γ-глобулинами, получила наименование иммуноглобулинов (Ig). Все пять классов иммуноглобулинов (IgМ, IgG, IgА, IgЕ и IgD) имеют разную молекулярную массу (от 15 000 до 900 000 Д) и различаются по антигенным свойствам, од­нако антитела определенной специфичности почти всегда пред­ставлены разными классами. Первыми после иммунизации появляются IgМ, затем IgG, позднее IgА с той же антительной специфичностью.

Основную массу иммуноглобулинов сыворотки составляют IgG — 70—80 %. На IgА приходится 10—15 %, на IgМ 5—10, а на IgЕ и IgD — только около 0,2 %.

Взаимодействие антиген—антитело возможно только в элект­ролитной среде (0,85%-ной по NаС1), а рН должен быть близок к нейтральному. Взаимодействие антигена с антителом происходит в первые же секунды или минуты. Визуально оно проявляется в виде агглютинации, преципитации и лизиса (может развиваться через несколько часов).

Комплекс антиген—антитело способен к диссоциации с элюированием (выведением) антител, чем пользуются при получении высокоспецифичных антител против антигена или его детерми­нанты. Это происходит при изменении рН среды до 9—10 или 5— 3, повышении концентрации NаС1 до 15 % и температуры до 60 °С.

В соответствии с антигенными особенностями вышеуказанные классы иммуноглобулинов делят еще на субклассы. Так, тяжелых цепей иммуноглобулинов описано более 20 аллотипов и т. д.

Динамика накопления и исчезновения антител из крови после иммунизации зависит от того, первично или вторично происходит взаимодействие организма с антигеном. В соответствии с этим различают первичный и вторичный иммунные ответы.

Первые антитела появляются в крови через 3—4 сут после вве­дения антигена. Вторичный иммунный ответ развивается не толь­ко после повторной иммунизации, проводимой через 2—4 нед после первой. Эта способность к усиленной реакции на антиген сохраняется много месяцев и лет как проявление иммунологичес­кой памяти.

Проблема создания методов культивирования лимфоидных иммунокомпетентных клеток, позволяющая инициировать им­мунный ответ в виде выработки антител in vitro(в пробирке), на­шла решение в разработке методики получения клеточных гибри­дов — гибридом от слияния нормальных лимфоцитов иммунизи­рованных животных с культивированными в питательной среде клетками миеломных штаммов с помощью полиэтиленгликоля. При этом гибриды от лимфоцита получают способность синтези­ровать определенное антитело и способность выживать в среде с ГАТ (гемантителами), а от миеломного «партнера» — способность бесконечно размножаться in vitro. Накопленный гибридомный клон может быть размножен, и синтезируемые им моноклональные антитела могут быть получены в любом количестве.

Гибриды создаются не только на основе В-лимфоцитов, синте­зирующих моноклональные антитела, но и на основе Т-лимфоцитов. Созданы культуры Т-гибридом, синтезирующие разные лимфокины.